背景^[1-3]

大鼠回腸細(xì)胞是一種來(lái)源于大鼠腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞，形態(tài)為上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)。該細(xì)胞污染支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性。

大鼠回腸細(xì)胞

大鼠回腸細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．大鼠回腸細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO，貨號(hào)11995-065)，95%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，5%，添加0.1U/ml胰島素。

2）大鼠回腸細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）大鼠回腸細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。

二．大鼠回腸細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）大鼠回腸細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細(xì)胞的培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.移入到事先準(zhǔn)備好的含有5ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中或含有14ml培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

3）大鼠回腸細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，先要消化處理并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。消化方法按照細(xì)胞傳代方法的1-3步驟進(jìn)行，最后的重懸液使用血清。懸浮細(xì)胞直接計(jì)數(shù)后離心，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中。

應(yīng)用^[4][5]

大鼠回腸細(xì)胞可以用于腸上皮γ-氨基丁酸能信號(hào)通路調(diào)節(jié)小腸液分泌及其作用機(jī)制

觀察GABA能信號(hào)系統(tǒng)是否在小腸組織表達(dá),尤其是在參與液體分泌的上皮細(xì)胞上的表達(dá)情況；探討GABA能信號(hào)系統(tǒng)在腸粘膜上皮表達(dá)的生理意義。

方法：RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))無(wú)菌條件下,將IEC-18(a cell line derived from the ileum of rat intestine)細(xì)胞種植于直徑為10cm的圓形培養(yǎng)皿中；待細(xì)胞濃度增殖達(dá)到90%以上時(shí),用4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline,PBS)沖洗細(xì)胞三次,加入Trizol試劑提取細(xì)胞RNA。健康成年雄性Wistar大鼠脫頸犧牲后,小心取出大腦組織,用4℃預(yù)冷的PBS沖洗3次,剝離出新鮮大腦皮質(zhì),剪碎后,加入Trizol提取組織RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明,提取細(xì)胞和組織的cDNA;然后用GABAA受體各亞單位和GAD65/67的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)的DNA。再用DNA凝膠電泳觀察各目的帶表達(dá)情況。

免疫組織化學(xué)石蠟切片染色步驟：將新鮮動(dòng)物組織用4%多聚甲醛(PFA)固定液浸泡24小時(shí)后,將組織脫水并用石蠟包埋后切片(組織厚度：4-5μm),依次進(jìn)行脫蠟、水化和抗原修復(fù)處理。用10%與二抗來(lái)源相同的血清室溫條件下封閉切片1小時(shí)后,加入一抗,4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。PBS沖洗切片3次,每次5分鐘,加入熒光標(biāo)記的二抗室溫避光孵育1小時(shí)。PBS沖洗3次,每次5分鐘,75%甘油緩沖液封片,熒光顯微鏡觀察拍片。

細(xì)胞免疫染色步驟：將IEC-18細(xì)胞種植在10%多聚賴氨酸(PDL)包被的蓋玻片上,培養(yǎng)48小時(shí),待細(xì)胞貼壁良好后,室溫條件下,用4%多聚甲醛迅速固定10分鐘,PBS沖洗三次,每次5分鐘,其余步驟同石蠟切片染色。Western Blot將新鮮組織或細(xì)胞勻漿后,4℃離心(12000g)10分鐘,取離心后的上清液進(jìn)行蛋白定量。用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)下層膠和5%的上層分離膠電泳,濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45微米的PVDF(Polyvinylidene Fluoride)膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1小時(shí),加入一抗覆蓋PVDF膜,4℃孵育過(guò)夜。用1倍的TTBS沖洗PVDF膜3次,每次10分鐘。室溫下加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育1小時(shí)。用1倍TTBS沖洗3次,每次10分鐘,ECL顯影。膜片鉗記錄實(shí)驗(yàn)將IEC-18細(xì)胞種植在10%多聚賴氨酸包被的蓋玻片上,24小時(shí)后待細(xì)胞貼壁,開(kāi)始全細(xì)胞記錄。記錄時(shí)用正常細(xì)胞外液(155mM NaC1、1.3mM CaC12,5.4mM KC1、25mM HEPES和33mM葡萄糖(pH7.4,滲透壓315mosmol/kgH2O))常溫循環(huán)灌流細(xì)胞,用700B放大器進(jìn)行記錄。

記錄電極內(nèi)液為155mM KC1、15mM KOH、10mM HEPES、2mM MgC12、1mM CaC12、10mM EGTA和2mM Tetraethylammonium(pH7.35,滲透壓315mosmol/kgH20)o電壓鉗記錄時(shí),將細(xì)胞膜電位鉗制在-60mV。信號(hào)采集后用低通濾波器(1-2kH)進(jìn)行濾波處理。

在體小腸液分泌實(shí)驗(yàn)成年雄性BALB/c小鼠,體重在25-30克之間,實(shí)驗(yàn)前禁食,自由飲水。用2%戊巴比妥鈉(45-50mg/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物,固定四肢和頭部,在恒溫條件下(36℃-38℃)行開(kāi)腹手術(shù)。在距離盲腸1-2cm處結(jié)扎回腸,沿向心端方向量取2cm回腸進(jìn)行結(jié)扎,使之形成長(zhǎng)約2cm的回腸襻,用直徑為0.33mm的胰島注射器向腸襻內(nèi)注射100μ1的生理鹽水或藥物,確保無(wú)滲漏后依次關(guān)閉腹腔各層。待動(dòng)物蘇醒后給予鼠糧和飲水。5小時(shí)后,脫頸犧牲小鼠,取出回腸襻,量取回腸襻的長(zhǎng)度和稱取去除腸液前后的腸襻重量,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

統(tǒng)計(jì)分析小腸液分泌試驗(yàn)中,用去除腸液前后重量差除以回腸襻的長(zhǎng)度(g/cm)作為觀察指標(biāo),比較對(duì)照組和處理組之間有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示,用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以P<0.05作為顯著性差異界值。

參考文獻(xiàn)

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