背景^[1-3]

HTR-8/SVNEO人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系是通過轉染人妊娠前期胎盤絨毛膜外植體的細胞獲得的，其基因編碼人猿病毒40大T抗原。這些轉染的滋養(yǎng)細胞可用于研究滋養(yǎng)細胞生物學和胎盤功能。它們可能提高我們對腫瘤進展、子癇前期胎盤異常低侵襲性和滋養(yǎng)細胞腫瘤高侵襲性相關疾病的認識。該細胞系已被證明同時包含上皮細胞和間充質樣細胞群。

HTR-8/SVNEO人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系

HTR-8/SVNEO人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系細胞培養(yǎng)操作

1)復蘇HTR-8/SVNEO人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主。

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)HTR-8/SVNEO人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3)HTR-8/SVNEO人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。

b、根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應用^[4][5]

HTR-8/SVNEO人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系可以用于TNF-α通過miR-145-5p下調Cyr61表達抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系HTR8/SVneo細胞侵襲能力的研究

以HTR8/SVneo細胞為模型,研究TNF-α/miR-145-5p/Cyr61軸對HTR8/SVneo侵襲和遷移能力的影響,并著重探討其中的分子機制,以期為子癇前期在臨床上的抗TNF-α治療提供依據,并試圖為臨床上子癇前期的早期診斷提供分子標志,為子癇前期的臨床治療提供靶標。

方法(1)分別利用轉化生長因子-β(TGF-β)、溶血磷脂酸(LPA)、白介素35(IL-35)和腫瘤壞死因子(TNF-α)處理HTR8/SVneo細胞,利用劃痕實驗檢測上述因子對HTR8/SVneo細胞遷移能力的影響,根據實驗結果選擇對HTR8/SVneo細胞遷移能力影響較大的細胞因子進一步研究分子機制。

(2) 根據篩選結果,選擇TNF-α做進一步研究,篩選TNF-α影響HTR8/SVneo細胞遷移能力的下游分子,使用不同濃度TNF-α處理HTR8/SVneo細胞,分別利用real time RT-PCR和Western blotting在mRNA和蛋白水平檢測侵襲相關轉錄因子MSH同源盒蛋白2(MSX2)、叉頭框蛋白M1(FOXM1)、轉錄因子插頭框蛋白O1(FOXO1)、信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)和富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)等分子的表達情況。

(3) 依據篩選結果,確定Cyr61為TNF-α影響HTR8/SVneo細胞遷移能力的主要下游分子,利用基因克隆技術分別構建Cyr61慢病毒表達載體和Cyr61靶向shRNA表達載體,轉染HEK293細胞包裝成慢病毒顆粒,感染HTR8/SVneo細胞,利用劃痕實驗、Transwell等檢測Cyr61對細胞遷移和侵襲能力的影響。

(4) 進一步證實探討TNF-α影響Cyr61表達的分子機制,利用生物信息學和real time RT-PCR技術篩選TNF-α處理HTR8/SVneo細胞后,miRNAs的表達譜變化,篩選到miR-145-5p在TNF-α處理HTR8/SVneo細胞后升高;利用生物信息學和雙熒光素報告系統(tǒng)驗證miR-145-5p對Cyr61 mRNA沉默作用;利用合成miR-145-5p mimics、anti-miR-145-5p分別轉染HTR8/SVneo細胞,Western blotting實驗用來檢測轉染后HTR8-SVneo細胞中Cyr61的表達情況。利用劃痕實驗、Transwell等檢測轉染細胞遷移和侵襲能力變化。在HTR8/SVneo細胞中轉染miR-145-5p inhibitor 48h后,用10 ng/mL TNF-α處理:劃痕實驗和Transwell實驗用來檢測TNF-α處理的HTR8/SVneo細胞中降低miR-145-5p表達對TNF-α介導的侵襲抑制的影響;

結果(1)分別利用不同濃度TGF-β、LPA、IL-35和TNF-α處理HTR8/SVneo細胞24h后,劃痕實驗結果表明,TGF-β、LPA和IL-35對細胞的遷移能力沒有明顯影響,但是,終濃度為10 ng/ml和100 ng/ml的TNF-α可以顯著抑制細胞的侵襲能力(P<0.05)。

(2) real time RT-PCR結果表明,TNF-α處理的HTR8/SVneo細胞中侵襲相關轉錄因子Msx2、FOXO1、FOXM1、STAT3和Cyr61 mRNA表達均沒有明顯變化;Western blotting結果顯示,TNF-α處理的HTR8/SVneo中侵襲相關轉錄因子Msx2、FOXO1、FOXM1和STAT3的表達沒有顯著變化,但是Cyr61蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。

(3) 成功構建了Cyr61表達載體(pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro-Cyr61)和Cyr61靶向shRNA表達載體(pLKO.1-Cyr61-shRNA-1和pLKO.1-Cyr61-shRNA-2),并包裝成重組慢病毒顆粒,感染HTR8/Svneo細胞;real time RT-PCR和Western blotting的檢測結果表明,在感染pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro-Cyr61重組慢病毒的HTR8/SVneo細胞中Cyr61在mRNA和蛋白水平表達均顯著升高(P<0.05)。而在兩株敲低細胞系中,Cyr61在mRNA和蛋白水平表達均顯著降低(P<0.05),而且pLKO.1-Cyr61-shRNA-1比pLKO.1-Cyr61-shRNA-2的效果要強。

用pLKO.1-Cyr61-shRNA-2穩(wěn)轉的細胞做后續(xù)實驗。劃痕實驗結果顯示,過表達Cyr61能夠促進HTR8/SVneo細胞的遷移率(P<0.05),而敲低Cyr61的表達則能夠顯著抑制HTR8/SVneo細胞的遷移率(P<0.05)。Transwell侵襲實驗,我們得到了相似的結果。劃痕實驗和Transwell侵襲實驗還顯示,與轉染載體的對照組細胞相比,過表達Cyr61的HTR8/SVneo細胞對TNF-α誘導的遷移和侵襲抑制具有明顯的翻轉效應。

參考文獻

[1]Lysophosphatidic acid induces the crosstalk between the endovascular human trophoblast and endothelial cells in vitro.Jimena S.Beltrame;;Leopoldina Scotti;;Micaela S.Sordelli;;Vanesa A.Ca?umil;;Ana M.Franchi;;Fernanda Parborell;;María L.Ribeiro.Journal of Cellular Physiology,2019

[2]miR-145 overexpression triggers alteration of the whole transcriptome and inhibits breast cancer development.Peng Ye;;Yu Shi;;Nairui An;;Qian Zhou;;Juan Guo;;Xinghua Long.Biomedicine&Pharmacotherapy,2018

[3]MiR‐634 sensitizes glioma cells to temozolomide by targeting CYR 61 through Raf‐ERK signaling pathway.Zhigang Tan;;Jizong Zhao;;Yugang Jiang.Cancer Medicine,2018

[4]MicroRNA-145 alleviates high glucose-induced proliferation and migration of vascular smooth muscle cells through targeting ROCK1.Mantian Chen;;Yi Zhang;;Wei Li;;Jieying Yang.Biomedicine&Pharmacotherapy,2018

[5]文政芳.TNF-α通過miR-145-5p下調Cyr61表達抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系HTR8/SVneo細胞侵襲能力的研究[D].廣西醫(yī)科大學,2019.