背景[1-3]
細胞凋亡-HOECHST染色試劑盒是一種經典的細胞凋亡檢測方法。這種試劑盒采用Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）雙染的方法，可以快速簡便地檢測細胞凋亡。
細胞凋亡-HOECHST染色試劑盒
細胞凋亡-HOECHST染色試劑盒操作步驟：
1.細胞樣品的制備：
⑴貼壁細胞：
①小心收集細胞培養(yǎng)液到一個無菌離心管內備用。
②用胰蛋白酶消化細胞至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。
③收集上述細胞懸液到離心管內，4℃1000g離心3～5 min，使細胞沉到管底，小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細胞。
④加入約1ml提前預冷的PBS，重懸細胞，并轉移至1.5ml無菌離心管，4℃1000g離心3～5min，使細胞沉到管底。
⑤小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細胞。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。
⑵懸浮細胞：
①4℃1000g離心3～5min，使細胞沉到管底，小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細胞。
②加入約1ml提前預冷的PBS，重懸細胞，并轉移至1.5ml無菌離心管，4℃1000g離心3～5min，使細胞沉到管底。
③小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細胞，輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。
2.配制Cell Stain Buffer工作液：取適量Cell Stain Buffer(2×)與無菌去離子水或蒸餾水等比例混合，即為Cell Stain Buffer工作液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3.重懸細胞：取上述收集好的0.1～1×106細胞，加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重懸細胞沉淀。
4.Hoechst 33258/PI染色：
⑴一步法：加入5μl Hoechst 33258 Stain和5μl PI Stain，輕輕混勻，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。
⑵兩步法：
①加入5μl Hoechst 33258 Stain，置于37℃水浴，孵育5～15 min
②置于冰水中冷卻后，4℃1000g離心3～5 min，使細胞沉到管底，棄上層染色液。
③加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重懸細胞沉淀。
④加入5μl PI Stain，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。
5.細胞凋亡-HOECHST染色試劑盒檢測與分析：用流式細胞儀在激發(fā)波長400～500nm檢測藍色熒光，在大于630nm處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用熒光顯微鏡檢測，檢測前4℃1000g離心3～5min沉淀細胞，用PBS洗滌一次，再涂片觀察紅色熒光和藍色熒光。對于貼壁細胞使用熒光顯微鏡檢測，亦可不收集細胞，棄培養(yǎng)液后直接依次按照上述比例加入試劑(A)、試劑(B)、試劑(C)，冰浴或4℃染色20～30min。染色后PBS洗滌一次，再在熒光顯微鏡下觀察。
細胞凋亡-HOECHST染色試劑盒染色結果：在藍色熒光對紅色熒光的散點圖上，正常細胞呈低藍光/低紅光，凋亡細胞呈高藍光/低紅光，壞死細胞呈低藍光/高紅光。
應用[4][5]
細胞凋亡-HOECHST染色試劑盒可以用于甘草素誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡及其機制的研究
甘草素抑制腫瘤細胞生長及誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡的研究目的:探討甘草素(liquiritigenin)對兩株腫瘤細胞生長的抑制作用及對人肝癌SMMC-7721細胞凋亡的誘導作用的影響。
方法:本研究采用體外培養(yǎng)人結腸癌Lovo細胞和人肝癌SMMC-7721細胞的方法,通過噻唑藍(MTT)比色法觀察甘草素對腫瘤細胞增殖的影響;Hoechst染色法和電鏡觀察甘草素誘導SMMC-7721細胞凋亡的形態(tài)變化;流式細胞儀檢測甘草素誘導SMMC-7721細胞凋亡率的變化情況。
結果:甘草素對Lovo結腸癌細胞作用24、48和72h時各劑量組出現生長抑制作用,其最高抑制率分別為15.4%、57.1%和84.7%;對SMMC-7721肝癌細胞作用24、48和72h時,各劑量組都已出現生長抑制作用,最高抑制率分別達到85.6%、94.2%和91.3%,并呈現明顯的劑量-效應關系。甘草素0.4mM作用SMMC-7721細胞12、24、48和72h,Hoechst染色觀察可見細胞核呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染;透射電鏡觀察可見0.4mM甘草素作用細胞72h后,細胞染色質濃縮、空泡。流式細胞儀檢測結果發(fā)現,甘草素可誘導SMMC-7721細胞凋亡,并呈時間-劑量效應關系,甘草素劑量為0.6mM作用24h后,即可引起23.52%的細胞發(fā)生凋亡。
結論:甘草素對人結腸癌Lovo細胞和人肝癌SMMC-7721細胞的生長均有抑制作用,其中對SMMC-7721肝癌細胞的生長抑制作用更加明顯,并能誘導SMMC-7721肝癌細胞細胞凋亡。
參考文獻
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[4]Expression of survivin mRNA associates with apoptosis,proliferationand histologically aggressive features in hepatocellular carcinoma.Soichiro Morinaga;;Yoshiyasu Nakamura;;Naoki Ishiwa;;Takaki Yoshikawa;;Yoshikazu Noguchi;;Yuji Yamamoto;;Yasushi Rino;;Toshio Imada;;Yoshinori Takanashi;;Makoto Akaike;;Yukio Sugimasa;;Shoji Takemiya.Oncology Reports,2004
[5]張世蘋.甘草素誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡及其機制的研究[D].南京醫(yī)科大學,2009.