背景^[1-3]

組織線粒體分離試劑盒可用于快速便捷分離組織/細(xì)胞線粒體，獲得的線粒體純度較高，且絕大部分都含有完整的內(nèi)膜和外膜，可用于線粒體的生理功能等方面的研究，得到的線粒體也可被相應(yīng)裂解液裂解得到線粒體蛋白，從而用于后續(xù)SDS-PAGE、Western、雙向電泳及免疫共沉淀等分析。

組織線粒體分離試劑盒

線粒體是絕大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)的一種基本的重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞的動(dòng)力工廠，細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化的場所。因此，對線粒體進(jìn)行分離，以此為對象，對線粒體呼吸作用、mtDNA、mtRNA以及其他線粒體蛋白性能分析等具有重要意義。

組織線粒體分離試劑盒使用方法

1線粒體的抽提

1）樣本處理

①組織勻漿：稱取100-200mg新鮮組織，PBS或生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，用剪刀剪成非常小的碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1-2.5mL冰預(yù)冷的試劑A，混勻，孵育8-10min，勻漿10-30下左右，也可采用超聲方法破膜。

②培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：消化細(xì)胞，PBS洗滌，800 g離心5-10 min收集細(xì)胞。計(jì)數(shù)，每次提取需要1-5×107個(gè)細(xì)胞，加入1-2.5mL預(yù)冷的試劑A，重懸細(xì)胞，混勻，孵育8-10min，可以采用超聲或勻漿器方法破膜。

2）將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，4℃，800 g離心5 min。

【注】：細(xì)胞核、大的膜碎片、未裂解細(xì)胞等沉淀在管底。

3）收集上清液并轉(zhuǎn)移到新的離心管。4 ℃，800 g再次離心5 min。棄沉淀。

4）將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管。4℃，12,000×g離心10 min，小心去除上清，沉淀即為分離得到的細(xì)胞線粒體。

【注】：離心后的上清含胞漿成分，盡量除去上清。

2線粒體蛋白的抽提

1）向每毫升預(yù)冷試劑B加入10μL試劑C混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。

2）按每10μL線粒體壓積中，加入100μL上述配制好的試劑B/C溶液。

3）置于4℃旋渦振蕩15-30 min。

4）10,000rpm，4℃離心15min，取上清，即為線粒體全蛋白提取物，進(jìn)行蛋白定量。

5）分裝保存于-70℃，避免反復(fù)凍融。

應(yīng)用^[4][5]

組織線粒體分離試劑盒可以用于豬PGC-1α、線粒體相關(guān)基因組織表達(dá)及Leptin對PGC-1α、UCPs mRNA表達(dá)的影響

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的亞細(xì)胞器,普遍存在于真核細(xì)胞中,其通過呼吸作用將糖、蛋白、脂類等生物大分子物質(zhì)氧化分解,釋放ATP,為機(jī)體提供能量。目前研究表明,線粒體不僅與能量代謝密切相關(guān),而且其也是影響肉質(zhì)嫩度及風(fēng)味的一個(gè)重要因素沒,本研究以豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：

(1) 利用RT-PCR方法分析線粒體相關(guān)基因PGC-1α、UCP2、UCP3、Cyt-c、CPT-Ⅰ組織差異表達(dá)特點(diǎn);

(2) 建立了豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)體系;(3)研究外源Leptin對豬成肌細(xì)胞中PGC-1α、UCPs mRNA表達(dá)的影響。

結(jié)論:1.PGC-1α基因進(jìn)行組織分布研究發(fā)現(xiàn):心臟、肝臟、肌肉、肺臟、腎臟、脾臟、皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪中均有的PGC-1αmRNA表達(dá),其中心臟、肝臟、肌肉的表達(dá)豐度最高,UCP2基因在、肌肉、皮下脂肪、腎臟、脾臟、內(nèi)臟脂肪中均有表達(dá),在心臟、肺中沒有檢測到表達(dá),其中腎臟表達(dá)豐度最高,在肌肉中次之,肝臟中的表達(dá)量最低。而內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪中UCP2基因mRNA表達(dá)豐度差異不顯著。UCP3基因在肌肉、皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪中均有表達(dá),在其他幾個(gè)組織中均沒有檢測到表達(dá),肌肉、皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪UCP3基因mRNA表達(dá)豐度差異不顯著。Cyt-c基因在心臟、肝臟、肌肉、皮下脂肪、腎臟、脾臟、內(nèi)臟脂肪、脾臟和肺中均有表達(dá),其中心臟中表達(dá)最高,肝臟、肌肉表達(dá)次之。CPT-Ⅰ基因mRNA在心臟、肝臟、肌肉、皮下脂肪、腎臟、脾臟、內(nèi)臟脂肪、脾臟和肺中均有表達(dá),其中肝臟中表達(dá)最高,心臟、腎臟、脾臟鏢達(dá)次之,而皮下脂肪的表達(dá)量高于肌肉(P<0.05)。

2. 用鏈酶蛋白酶、胰酶、膠原酶分別消化骨骼肌組織塊,結(jié)果表明,鏈酶蛋白酶消化所獲得的肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)顯著高于胰酶和膠原酶。在一定的消化時(shí)間內(nèi),膠原酶消化的效果較差,消化物中含大量的肌束,所獲得肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量很少。三種酶消化所得細(xì)胞活率無顯著差異。用Desmin抗體及ABC染液進(jìn)行間接免疫酶染色,RT-PCR方法檢測MyoG和MyoD的表達(dá),結(jié)果顯示鏈酶蛋白酶消化所得肌衛(wèi)星細(xì)胞95%呈陽性反應(yīng),培養(yǎng)7天后MyoG和MyoD均有表達(dá),說明分離得到是肌衛(wèi)星細(xì)胞。

3. 半定量RT-PCR分析結(jié)果表明,30和100 nmol/L的Leptin均可促進(jìn)PGC-1a轉(zhuǎn)錄,100 nmol/L Leptin處理12 h后可促進(jìn)PGC-1αmRNA表達(dá);處理24 h后,PGC-1αmRNA水平顯著高于對照組(p<0.05)。30 nmol/L處理24 h后可提高PGC-1αmRNA水平,但其促進(jìn)效果明顯低于100 nmol/L處理組(p<0.05)。半定量RT-PCR分析結(jié)果表明,30 nmol/L Leptin可明顯提高成肌細(xì)胞中UCP2mRNA的表達(dá),處理12和24 h后UCP2mRNA水平顯著高于對照組,且作用24 h促進(jìn)效果明顯優(yōu)于12 h處理效果(p<0.05),100 nmol/L Leptin提高成肌細(xì)胞中UCP2mRNA的表達(dá),處理12和24 h后UCP2mRNA水平顯著高于對照組,但作用效果顯著低于12和24 h后30 nmol/L Leptin作用效果(p<0.05)。30和100 nmol/L Leptin在時(shí)間上和劑量上,均不影響UCP3mRNA水平表達(dá)水平(p<0.05)。

綜上所述,線粒體相關(guān)基因表達(dá)存在明顯的組織差異性,PGC-1a在富含線粒體的組織中表達(dá)較高,表明其與線粒體發(fā)育存在明顯相關(guān)。其它基因根據(jù)組織能量需求及代謝特點(diǎn)不同而表達(dá)有所差異。外源添加不同濃度的Leptin顯著影響PGC-1α和UCP表達(dá),提示leptin可通過調(diào)控線粒體而影響機(jī)體能量代謝。

參考文獻(xiàn)

[1]Metabolic control through the PGC-1 family of transcription coactivators.Jiandie Lin;;Christoph Handschin;;Bruce M.Spiegelman.Cell Metabolism,2005

[2]Transcriptional coactivator PGC-1αcontrols the energy state and contractile function of cardiac muscle.Zoltan Arany;;Huamei He;;Jiandie Lin;;Kirsten Hoyer;;Christoph Handschin;;Okan Toka;;Ferhaan Ahmad;;Takashi Matsui;;Sherry Chin;;Pei-Hsuan Wu;;Igor I.Rybkin;;John M.Shelton;;Monia Manieri;;Saverio Cinti;;Frederick J.Schoen;;Rhonda Bassel-Duby;;Anthony Rosenzweig;;Joanne S.Ingwall;;Bruce M.Spiegelman.Cell Metabolism,2005

[3]NO-1886(ibrolipim),a lipoprotein lipase activator,increases the expression of uncoupling protein 3 in skeletal muscle and suppresses fat accumulation in high-fat diet–induced obesity in rats.Masataka Kusunoki;;Kazuhiko Tsutsumi;;Koshi Iwata;;Weidong Yin;;Takao Nakamura;;Hitoshi Ogawa;;Tomoko Nomura;;Koya Mizutani;;Arao Futenma;;Keiko Utsumi;;Tetsuro Miyata.Metabolism,2005

[4]EFFECT OF ULTRASONIC STIMULATION ON mRNA ABUNDANCE OF UNCOUPLING PROTEIN(UCP)2 AND UCP 3 IN GASTROCNEMIUS MUSCLE OF RATS.AkinoriKogure;ToshihideYoshida;YasutoTakakura;TsunekazuUmekawa;ChizukoHioki;KeijiYoshioka;KanjiYoshimoto;ToshikazuYoshikawa.Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,2005

[5]文旭輝.豬PGC-1α、線粒體相關(guān)基因組織表達(dá)及Leptin對PGC-1α、UCPs mRNA表達(dá)的影響[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2007.