背景[1-3]
支原體染色檢測(cè)試劑盒是利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）檢測(cè)支原體污染。這種染料會(huì)結(jié)合到DNA的A-T富集區(qū)域，因?yàn)橹гw的DNA中A-T含量高（55％～80％），所以可將其染色而被檢測(cè)到。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后在細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體的DNA染色斑，說明有支原體污染。Hoechst 33258的激發(fā)波長(zhǎng)為346nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后，激發(fā)波長(zhǎng)為352nm，發(fā)射波長(zhǎng)為461nm。
支原體染色檢測(cè)試劑盒
支原體染色檢測(cè)試劑盒操作步驟：
貼壁細(xì)胞：
1.被檢細(xì)胞接種于無(wú)菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為1-2×104。同時(shí)，接種正常無(wú)支原體感染的同種細(xì)胞，作為陰性對(duì)照。
2.5天后，先吸去培養(yǎng)液，再加入1ml的固定液，靜置20min，
3.吸去固定液，晾干。
4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞），37℃避光放置15-20min或室溫靜置20～30min。
5.吸去Hoechst 33258工作液，加入2ml滅菌超純水洗滌三次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封片液，并以蓋玻片覆蓋。
6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。
懸浮細(xì)胞：
1.收集需檢測(cè)的細(xì)胞，1500rpm，5min。
2.將收集的細(xì)胞涂片于載玻片上，再加1ml的固定液，靜置20min。
3.吸去固定液，晾干。
4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞），37℃避光放置15～20min或室溫靜置20～30min。
5.吸去Hoechst 33258工作液，用無(wú)菌水洗滌玻片3次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封固液，并以蓋玻片覆蓋。
6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。
支原體染色檢測(cè)試劑盒結(jié)果判斷：
陰性：僅見細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光。
陽(yáng)性：除細(xì)胞外，細(xì)胞周圍可見大量的大小均一的熒光著色顆粒。
應(yīng)用[4][5]
支原體染色檢測(cè)試劑盒可以用于細(xì)胞庫(kù)支原體檢測(cè)體系以及支原體去除方法的建立
生命科學(xué)迎來了繁榮發(fā)展的時(shí)代。從生物石油到藥品、醫(yī)療,無(wú)一不和生命科學(xué)息息相關(guān)。細(xì)胞株作為生命科學(xué)研究的重要材料顯得尤為重要。無(wú)污染的細(xì)胞株是得到可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的前提。作為國(guó)家級(jí)細(xì)胞株保藏中心,監(jiān)測(cè)細(xì)胞株的質(zhì)量一直是本細(xì)胞庫(kù)重點(diǎn)工作之一。
細(xì)胞株的微生物污染源一般有細(xì)菌、真菌、支原體。細(xì)菌和真菌污染細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)導(dǎo)致培養(yǎng)基變色,鏡下可以看到菌體。但細(xì)胞株感染支原后培養(yǎng)基通常不會(huì)有顏色變化,更不能在普通顯微鏡下觀察到。支原體會(huì)影響培養(yǎng)細(xì)胞的各項(xiàng)參數(shù),甚至導(dǎo)致細(xì)胞株死亡,因此建立細(xì)胞庫(kù)支原體檢測(cè)體系以及支原體去除方法非常必要。
本研究結(jié)合本庫(kù)自身情況選用最易操作的三種方法:DNA染色、直接培養(yǎng)法、PCR,對(duì)本細(xì)胞庫(kù)保藏的常用的100種細(xì)胞株進(jìn)行支原體檢測(cè)。根據(jù)各不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)建立適用于本細(xì)胞庫(kù)的支原體檢測(cè)流程體系:入庫(kù)前PCR試劑盒預(yù)檢、入庫(kù)后三項(xiàng)全檢、日常兩項(xiàng)監(jiān)控、供應(yīng)中自建PCR檢測(cè)。
在有支原體污染的細(xì)胞株中選取珍貴、稀有、且國(guó)內(nèi)研究者急需求的細(xì)胞株為研究對(duì)象,同時(shí)使用BM-Cyclin和MC-210兩種藥劑去除支原體。在支原體去除后的一周、一個(gè)月、一年的時(shí)間段里,重復(fù)檢測(cè)支原體污染,用以評(píng)價(jià)兩種藥劑效果和優(yōu)缺點(diǎn)。通過對(duì)比,最終確定BM-Cyclin為細(xì)胞庫(kù)去除支原體污染的首選藥劑。
參考文獻(xiàn)
[1]Treatment of Mycoplasma Contamination in Cell Cultures with Plasmocin.Cord C.Uphoff;;Sabine-A.Denkmann;;Hans G.Drexler;;Elvira Gonzalez De Mejia.Journal of Biomedicine and Biotechnology,2012
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[3]Highlights of mycoplasma research—An historical perspective.Shmuel Razin;;Leonard Hayflick.Biologicals,2009
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[5]夏晴.細(xì)胞庫(kù)支原體檢測(cè)體系以及支原體去除方法的建立[D].上海交通大學(xué),2014.