背景^[1-3]

RF6A猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜(內(nèi)皮)細(xì)胞系取自64日孕期胎猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜，細(xì)胞表達(dá)因子VIII、纖維連接蛋白基因。RF/6A細(xì)胞在早期自發(fā)轉(zhuǎn)化并已傳代540次以上，電鏡下觀察到Weibel-Palade顆粒。高代次的RF/6A細(xì)胞用作滋養(yǎng)層以增強(qiáng)貼壁、轉(zhuǎn)接能力和供養(yǎng)眼色素層黑素細(xì)胞。EXPASY細(xì)胞庫(kù)顯示，細(xì)胞屬性可能被誤認(rèn)，雖然最初被認(rèn)為是一種內(nèi)皮細(xì)胞系，但已證明缺乏這種細(xì)胞類型的功能和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。

RF6A猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜(內(nèi)皮)細(xì)胞系

RF6A猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜(內(nèi)皮)細(xì)胞系細(xì)胞處理：

凍存RF6A猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜(內(nèi)皮)細(xì)胞系細(xì)胞的復(fù)蘇：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

RF6A猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜(內(nèi)皮)細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁RF6A猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜(內(nèi)皮)細(xì)胞系細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

RF6A猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜(內(nèi)皮)細(xì)胞系細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活RF6A猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜(內(nèi)皮)細(xì)胞系細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

應(yīng)用^[4][5]

RF6A猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜(內(nèi)皮)細(xì)胞系可以用于茶葉中的脂肪酸及其對(duì)脈絡(luò)膜—視網(wǎng)膜RF/6A內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

探討茶葉中的脂肪酸,是否與視網(wǎng)膜健康相關(guān),正是論文研究的目的。

本文利用氣相色譜法對(duì)茶樹(shù)鮮葉不同葉位中脂肪酸的組成進(jìn)行了測(cè)定和分析,結(jié)果表明茶葉的脂肪酸組成主要為長(zhǎng)鏈脂肪酸,其中,以棕櫚酸(C16:0)和亞油酸(C16:2)、亞麻酸(C18:3)為主。櫧葉齊品種茶葉中亞油酸和亞麻酸的含量占脂肪酸總量的49.0～65.2%,含量最高的第二葉為3.16毫克/克鮮葉,其中亞油酸1.25毫克/克鮮葉,亞麻酸1.91毫克/克鮮葉;采用恒河猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(Rhesur macaqud choroids-retinal endothelial cells,RF/6A)培養(yǎng)體系研究了棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸三種長(zhǎng)鏈脂肪酸對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,通過(guò)研究亞油酸對(duì)自由基的清除作用及其對(duì)脂質(zhì)體中氧消耗的分析,探討了不飽和脂肪酸與視網(wǎng)膜脂質(zhì)過(guò)氧化之間的關(guān)系。

MTT(四甲基偶氮唑鹽)法檢測(cè)不同濃度脂肪酸單體作用不同時(shí)間對(duì)RF/6A細(xì)胞活力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同結(jié)構(gòu)的三種長(zhǎng)鏈脂肪酸在低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞的影響有差異。小于400μM棕櫚酸對(duì)細(xì)胞存活率影響不大,ω-6系列亞油酸和ω-3系列亞麻酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,其中,40-200μM亞麻酸處理細(xì)胞24小時(shí)使細(xì)胞增殖達(dá)到極顯著差異。

同時(shí),三種脂肪酸在較高濃度下可抑制細(xì)胞活力。500μM棕櫚酸、400μM亞油酸、300μM亞麻酸分別處理細(xì)胞不同時(shí)間(12,24,36,46小時(shí))后能顯著降低存活率。

參考文獻(xiàn)

[1]Docosahexaenoic and arachidonic acid influence on preterm baboon retinal composition and function.Guan-Yeu Diau,Ellis R.Loew,Vasuki Wi jendran,et al.Investigative ophthalmology and visual science.2003

[2]The role of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina.SanGiovarmi JP,Chew EY.Prog Retin Eye Res.2005

[3]Ju-Ming;Saturated free fatty acids,palmitic acid and stearic acid,induce apoptosis by stimulation of ceramide generation in rat testicular Leydig cell.Lu,Zhao-Hui;Mu,Yi-Ming;Wang,Bao-An;Li,Xie-Ling;Lu.Biochemical and Biophysical Research Communications.

[4]Changes of Fatty Acid Contents,Lipoxygenase Activities,and Volatiles during Black Tea Mnaufacture.P.K.Mahanta,et al.J.Agric.Food Chem.1993

[5]陳萍.茶葉中的脂肪酸及其對(duì)脈絡(luò)膜—視網(wǎng)膜RF/6A內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[D].浙江大學(xué),2006.