背景^[1-3]

MARC145](非洲綠猴胚胎腎細胞)來源于一非洲綠猴的胚胎腎組織的上皮樣細胞，從母細胞(MA-104細胞)克隆而得到，可連續(xù)傳代培養(yǎng)。此細胞主要用于病毒的培養(yǎng)，特別是2007年爆發(fā)的豬藍耳病病毒對此細胞尤為敏感，是豬藍耳病病毒及其防控技術(shù)研究中的重要材料。

MARC145](非洲綠猴胚胎腎細胞)

MARC145](非洲綠猴胚胎腎細胞)處理：

1）凍存MARC145](非洲綠猴胚胎腎細胞)的復(fù)蘇：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2）MARC145](非洲綠猴胚胎腎細胞)傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮人BURKITT淋巴瘤細胞，傳代可參考以下方法：

懸浮狀態(tài)下生長的細胞，可以通過向培養(yǎng)瓶中添加完全培養(yǎng)基來維持細胞的生長狀態(tài)，一般情況下細胞密度維持在1×105~1×10^6個/mL（不同細胞對密度要求不同，）可以維持細胞的正常生長。如需分瓶可以將細胞懸液收集到離心管中1000rpm，離心5min，棄去上清，補加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）MARC145](非洲綠猴胚胎腎細胞)凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。

應(yīng)用^[4][5]

MARC145](非洲綠猴胚胎腎細胞)可以用于豬源唾液酸黏附素介導(dǎo)PRRS病毒感染Marc145細胞的適應(yīng)性研究

借助CRISPR/Cas9技術(shù)對Marc145細胞的基因組進行修飾和改造,構(gòu)建穩(wěn)定表達豬源Sn(p Sn)的Marc145細胞株(p Sn-Marc145),以期提高PRRSV的細胞吸附能力及其適應(yīng)性和感染性,為PRRSV的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究提供可靠的細胞平臺支撐。

【方法】選擇Marc145細胞第11號染色體RACGAP1和ASIC1基因之間的內(nèi)含子序列作為打靶區(qū)域。首先,利用生物學(xué)軟件設(shè)計單向?qū)NA(sg RNA)并構(gòu)建Cas9打靶質(zhì)粒,通過軟件分析和Surveyor檢測試劑盒篩選脫靶效率較低的sg RNA;并利用編碼增強型綠色熒光蛋白(e GFP)的供體質(zhì)粒進行同源重組修復(fù),借助熒光顯微鏡觀察、Junction PCR、Southern Blotting等方法來確定外源基因是否可以特異性重組至靶向區(qū)域并有效表達。隨后,根據(jù)所選sg RNA,構(gòu)建并比較不同Cas9突變體打靶質(zhì)粒的切割效率;選擇脫靶效率低、切割效率和同源重組較高的Cas9打靶質(zhì)粒用于p Sn-Marc145細胞的構(gòu)建:在CRISPR/Cas9系統(tǒng)的介導(dǎo)下,將p Sn基因序列經(jīng)供體質(zhì)粒整合至Marc145細胞基因組中。嘌呤霉素加壓條件下,挑取單克隆細胞并擴大培養(yǎng);對經(jīng)Junction PCR、Southern Blotting、Western Blotting、間接免疫熒光試驗鑒定為陽性的克隆進行核型分析、細胞形態(tài)觀察以及生長周期活性評估。最終,在正常的Marc145和p Sn-Marc145細胞上,比對研究制苗用PRRSV(VR2332、CH1R、R98、JXA1)和野生型PRRSV(GSWW2018和GSKL)的生物學(xué)特性。

【結(jié)果】共設(shè)計合成了5種sg RNA(sg RNA-3、-17、-23、-24、-33),其中sg RNA-24的脫靶效率最低;該打靶質(zhì)粒能夠?qū)⒐w質(zhì)粒攜載的e GFP定點整合于RACGAP1和ASIC1基因之間的內(nèi)含子中并檢測到特異性綠色熒光。3種Cas9突變體(p Sp Cas9、Cas9n、e Cas9)中,Cas9n(含雙sg RNA)打靶質(zhì)粒的切割效率最高;將Cas9n(含雙sg RNA)打靶質(zhì)粒和p Sn供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常的Marc145細胞后,獲得了2株靶向單一整合的p Sn-Marc145重組細胞(24-15-7、24-15-9),單細胞陽性克隆在保持正常Marc145細胞遺傳特征和細胞形態(tài)的同時,表現(xiàn)出更優(yōu)的生長活性。通過蝕斑形成試驗、間接免疫熒光試驗、病毒生長曲線的繪制、Western Blotting和實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),盡管p Sn的表達對PRRSV疫苗生產(chǎn)用毒種在Marc145細胞中的毒力和復(fù)制能力影響不大,但顯著提高高致病性PRRSV(HR-PRRSV,JXA1)的吸附能力;通過傳代培養(yǎng)、遺傳變異分析、實時熒光定量PCR、蝕斑形成試驗和病毒生長曲線的繪制發(fā)現(xiàn),2株野生型PRRSV在p Sn-Marc145細胞上具有明顯強于其在正常Marc145細胞上的適應(yīng)性和感染性。

【結(jié)論】綜上所述研究結(jié)果表明:一、Marc145細胞基因組中第11號染色體RACGAP1和ASIC1基因之間的內(nèi)含子區(qū)域可作為外源基因定點打靶的有效位點。

二、利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的p Sn-Marc145細胞株在HP-PRRSV疫苗生產(chǎn)和野生型PRRSV分離過程中具有良好的應(yīng)用潛力。

參考文獻

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