背景[1-3]
活性氧檢測試劑盒是一種基于熒光染料DCFH-DA的熒光強度變化，定量檢測細胞內(nèi)活性氧水平的試劑盒。
DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被標記到細胞內(nèi)。在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成熒光物質DCF，綠色熒光強度與細胞內(nèi)活性氧水平成正比，檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nèi)活性氧的水平。在激發(fā)波長502nm，發(fā)射波長530nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀等檢測DCF熒光，從而測定細胞內(nèi)活性氧水平。
活性氧(ROS)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。
活性氧檢測試劑盒
活性氧檢測試劑盒操作步驟：
裝載探針
對于刺激時間較短(通常為2小時以內(nèi))的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。
原位裝載探針(僅適用于貼壁細胞)
細胞準備：檢測前一天進行細胞鋪板，確保檢測時細胞匯合度達到50～70%。
探針準備：探針裝載前按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。
探針裝載：吸除細胞培養(yǎng)液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，如，對于6孔板通常不少于1000μL，對于96孔板通常不少于100μL。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20～30min。
細胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。
藥物誘導：加入適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導時間根據(jù)藥物本身特性，以及細胞類型來決定。
(可選)陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等1:1000稀釋陽性對照(Rosup,50mg/ml)，加入細胞，一般37℃避光孵育20～30min可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異。(如，HeLa細胞孵育30min；MRC5人胚胎成纖維細胞1.5h)
收集細胞后裝載探針(適用于貼壁細胞和懸浮細胞)
細胞準備：按照標準方法培養(yǎng)細胞，必須保證檢測用細胞狀態(tài)健康。按照適當方法，清洗并收集足量的細胞。
探針準備：探針裝載前，按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。
探針裝載：細胞收集后懸浮于加入適當體積稀釋好的DCFH-DA工作液，使其細胞密度為1.0×106～2.0×107/mL，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20～30min，每隔3～5min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。
注：細胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進行調整。如，對于流式分析，單管檢測內(nèi)細胞數(shù)目不少于104，也不可多于106。
細胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。
藥物誘導：將細胞懸浮于適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物中，或把細胞等分成若干份后再進行藥物刺激，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導時間根據(jù)藥物本身特性，以及細胞類型來決定。
(可選)陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等1:1000稀釋陽性對照(Rosup,50mg/ml)，加入細胞，一般37℃避光孵育20～30min可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異。(如，HeLa細胞孵育30min；MRC5人胚胎成纖維細胞1.5h)。
檢測
原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。
收集細胞后裝載探針：用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
參數(shù)設置
使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設置檢測DCF。
應用[4][5]
活性氧檢測試劑盒可以用于微囊藻毒素-LR對中國倉鼠卵巢細胞的氧化應激和凋亡作用
以中國倉鼠卵巢(CHO)細胞為模型,經(jīng)MC-LR暴露后,檢測CHO細胞活性的變化,及細胞內(nèi)活性氧、抗氧化酶、脂質過氧化水平,線粒體膜電位,天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性和細胞凋亡率的變化,從分子水平探討MC-LR對CHO細胞的毒性作用,為闡明MC-LR的生殖毒性作用提供理論基礎。
方法：1.建立傳代培養(yǎng)的CHO細胞模型。
2. 用四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法檢測MC-LR對CHO細胞活性的影響：不同濃度的MC-LR(0μg/ml,1μig/ml,5μg/ml,10μg/ml15μg/ml)處理CHO細胞24h后,用MTT染色,測各組吸光度,計算細胞活性。
3. 集落形成實驗：用不同濃度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml)處理CHO細胞24h,計算各組集落形成能力,評價MC-LR對單個CHO細胞增殖能力的影響。4.檢測MC-LR對CHO細胞中過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的影響：用不同濃度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)處理CHO細胞,24h后收集細胞,用2,7-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)法測定ROS,硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA,可見分光光度法測定CAT。
4. 線粒體膜電位檢測試劑盒檢測不同劑量MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/m1)染毒24h后CHO細胞線粒體膜電位的變化。
5. Caspase-3底物切除法檢測MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)對CHO細胞中caspase-3性的影響。
6. 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染色結合流式細胞術檢測不同濃度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)染毒24h后細胞凋亡率的變化。
結果：1.MC-LR(0μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml)處理CHO細胞24h后,MTT法檢測結果顯示隨著毒素濃度升高,細胞形態(tài)逐漸改變,細胞活性逐漸降低。且與對照組相比,5μg/ml、10μg/ml和15gg/ml染毒組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。集落形成實驗中隨著染毒濃度增加,集落形成能力下降,與上述結果一致,也證明MC-LR能抑制CHO細胞活性。
參考文獻
[1]Subchronic microcystin‐lr exposure increased hepatic apoptosis and induced compensatory mechanisms in mice[J].NoeliaLezcano;DanielaSedán;IgnacioLucotti;LedaGiannuzzi;LeticiaVittone;DaríoAndrinolo;CeciliaMundi?a‐Weilenmann.J.Biochem.Mol.Toxicol.,2012(4)
[2]Oxdative stress on sertoli cells of rats induced by microcystin-LR☆[J].Dan Yi;;Xiaohui Liu;;Fengquan Zhang;;Jun wang;;Yang Zhao;;Dongjie Sun;;Jinwei Ren;;Huizhen Zhang.Life Science Journal,2011(2)
[3]Microcystin-LR induces cytoskeleton system reorganization through hyperphosphorylation of tau and HSP27 via PP2A inhibition and subsequent activation of the p38 MAPK signaling pathway in neuroendocrine(PC12)cells[J].Guanmin Meng;;Yu Sun;;Wenyu Fu;;Zonglou Guo;;Lihong Xu.Toxicology,2011(2)
[4]iTRAQ-based proteomic study of the effects of microcystin-LR on medaka fish liver.[J].Malécot Mélodie;;Marie Arul;;Puiseux-Dao Simone;;Edery Marc.Proteomics,2011(10)
[5]易丹.微囊藻毒素-LR對中國倉鼠卵巢細胞的氧化應激和凋亡作用[D].鄭州大學,2012.