背景^[1-3]

活性氧檢測試劑盒是一種基于熒光染料DCFH-DA的熒光強(qiáng)度變化，定量檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的試劑盒。

DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被標(biāo)記到細(xì)胞內(nèi)。在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成熒光物質(zhì)DCF，綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比，檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。在激發(fā)波長502nm，發(fā)射波長530nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等檢測DCF熒光，從而測定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。

活性氧(ROS)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細(xì)胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。

活性氧檢測試劑盒

活性氧檢測試劑盒操作步驟：

裝載探針

對于刺激時(shí)間較短(通常為2小時(shí)以內(nèi))的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(通常為6小時(shí)以上)的細(xì)胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

原位裝載探針(僅適用于貼壁細(xì)胞)

細(xì)胞準(zhǔn)備：檢測前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，確保檢測時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到50～70%。

探針準(zhǔn)備：探針裝載前按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。

探針裝載：吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，如，對于6孔板通常不少于1000μL，對于96孔板通常不少于100μL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20～30min。

細(xì)胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

藥物誘導(dǎo)：加入適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)藥物本身特性，以及細(xì)胞類型來決定。

(可選)陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等1:1000稀釋陽性對照(Rosup,50mg/ml)，加入細(xì)胞，一般37℃避光孵育20～30min可顯著看到活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會有比較明顯差異。(如，HeLa細(xì)胞孵育30min；MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞1.5h)

收集細(xì)胞后裝載探針(適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞)

細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，必須保證檢測用細(xì)胞狀態(tài)健康。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。

探針準(zhǔn)備：探針裝載前，按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。

探針裝載：細(xì)胞收集后懸浮于加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA工作液，使其細(xì)胞密度為1.0×106～2.0×107/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20～30min，每隔3～5min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。

注：細(xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進(jìn)行調(diào)整。如，對于流式分析，單管檢測內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不少于104，也不可多于106。

細(xì)胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

藥物誘導(dǎo)：將細(xì)胞懸浮于適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物中，或把細(xì)胞等分成若干份后再進(jìn)行藥物刺激，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)藥物本身特性，以及細(xì)胞類型來決定。

(可選)陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等1:1000稀釋陽性對照(Rosup,50mg/ml)，加入細(xì)胞，一般37℃避光孵育20～30min可顯著看到活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會有比較明顯差異。(如，HeLa細(xì)胞孵育30min；MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞1.5h)。

檢測

原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。

收集細(xì)胞后裝載探針：用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

參數(shù)設(shè)置

使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。

應(yīng)用^[4][5]

活性氧檢測試劑盒可以用于微囊藻毒素-LR對中國倉鼠卵巢細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡作用

以中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞為模型,經(jīng)MC-LR暴露后,檢測CHO細(xì)胞活性的變化,及細(xì)胞內(nèi)活性氧、抗氧化酶、脂質(zhì)過氧化水平,線粒體膜電位,天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性和細(xì)胞凋亡率的變化,從分子水平探討MC-LR對CHO細(xì)胞的毒性作用,為闡明MC-LR的生殖毒性作用提供理論基礎(chǔ)。

方法：1.建立傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞模型。

2. 用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法檢測MC-LR對CHO細(xì)胞活性的影響：不同濃度的MC-LR(0μg/ml,1μig/ml,5μg/ml,10μg/ml15μg/ml)處理CHO細(xì)胞24h后,用MTT染色,測各組吸光度,計(jì)算細(xì)胞活性。

3. 集落形成實(shí)驗(yàn)：用不同濃度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml)處理CHO細(xì)胞24h,計(jì)算各組集落形成能力,評價(jià)MC-LR對單個(gè)CHO細(xì)胞增殖能力的影響。4.檢測MC-LR對CHO細(xì)胞中過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的影響：用不同濃度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)處理CHO細(xì)胞,24h后收集細(xì)胞,用2,7-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)法測定ROS,硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA,可見分光光度法測定CAT。

4. 線粒體膜電位檢測試劑盒檢測不同劑量MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/m1)染毒24h后CHO細(xì)胞線粒體膜電位的變化。

5. Caspase-3底物切除法檢測MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)對CHO細(xì)胞中caspase-3性的影響。

6. 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)染毒24h后細(xì)胞凋亡率的變化。

結(jié)果：1.MC-LR(0μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml)處理CHO細(xì)胞24h后,MTT法檢測結(jié)果顯示隨著毒素濃度升高,細(xì)胞形態(tài)逐漸改變,細(xì)胞活性逐漸降低。且與對照組相比,5μg/ml、10μg/ml和15gg/ml染毒組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。集落形成實(shí)驗(yàn)中隨著染毒濃度增加,集落形成能力下降,與上述結(jié)果一致,也證明MC-LR能抑制CHO細(xì)胞活性。

參考文獻(xiàn)

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