背景[1-7]
Ac-IETD-pNA(Caspase 8顯色底物)Ac-VEID-pNA(Caspase 8顯色底物)是采用分光光度法檢測細(xì)胞或組織裂解液中caspase 8酶活性或純化的caspase 8酶活性的顯色底物。
原理:caspase 8可以催化底物Ac-VEID-pNA(acetyl-Val-Glu-Ilel-Asp p-nitroanilide)產(chǎn)生黃色的pNA(p-nitroaniline)，從而可以通過測定吸光度來檢測caspase 8的活性。pNA在405nm附近有強(qiáng)吸收。Caspase-8是一種caspase蛋白，由CASP8基因編碼。它很可能作用于caspase-3。已經(jīng)在許多哺乳動物中鑒定了CASP8直向同源物，其中可獲得完整的基因組數(shù)據(jù)。這些獨(dú)特的直向同源物也存在于鳥類中。CASP8基因編碼的成員半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（胱天蛋白酶）家族。半胱氨酸蛋白酶的順序激活在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著重要作用。
半胱天冬酶作為無活性酶原存在，其由前結(jié)構(gòu)域，大蛋白酶亞基和小蛋白酶亞基組成。半胱天冬酶的激活需要在保守的內(nèi)部天冬氨酸殘基處進(jìn)行蛋白水解加工，以產(chǎn)生由大小亞基組成的異二聚體酶。這種蛋白質(zhì)參與由...誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡Fas和各種凋亡刺激。該蛋白的N末端FADD樣死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域表明它可能與Fas相互作用蛋白FADD相互作用。
在來自亨廷頓病患者的受影響腦區(qū)域的不溶性部分中檢測到該蛋白質(zhì)，但在來自正常對照的那些中檢測不到，這暗示了神經(jīng)退行性疾病中的作用。已經(jīng)描述了編碼不同同種型的許多可變剪接的轉(zhuǎn)錄物變體，盡管并非所有變體都具有確定的全長序列。非常罕見的免疫系統(tǒng)遺傳疾病也可能由該基因的突變引起。這種疾病稱為CEDS，代表“Caspase 8缺乏狀態(tài)。”
CEDS具有與ALPS相似的特征，ALPS是另一種凋亡遺傳疾病，具有免疫缺陷表型。因此，臨床表現(xiàn)包括脾腫大和淋巴結(jié)腫大，以及復(fù)發(fā)性肺竇感染，復(fù)發(fā)性粘膜皮膚皰疹病毒，持續(xù)性疣和傳染性軟疣感染以及低丙種球蛋白血癥。實(shí)質(zhì)上有時存在淋巴細(xì)胞浸潤性疾病器官，但自身免疫性最小，并且在CEDS患者中未觀察到淋巴瘤。CEDS以常染色體隱性方式遺傳。
caspase-8被認(rèn)為主要是促凋亡蛋白酶，其主要參與來自腫瘤壞死因子受體家族死亡受體如Fas的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。淋巴細(xì)胞活化和保護(hù)性免疫的缺陷表明caspase-8在淋巴細(xì)胞中具有額外的信號傳導(dǎo)作用。
進(jìn)一步的研究表明，caspase-8對T，B和自然殺傷細(xì)胞中抗原受體，F(xiàn)c受體或Toll樣受體4刺激后誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子“核因子κB”（NF-κB）至關(guān)重要。在生物化學(xué)上，發(fā)現(xiàn)caspase-8與上游Bcl10-MALT1（粘膜相關(guān)淋巴組織）銜接子復(fù)合物進(jìn)入NF-κB激酶抑制劑（IKK）的復(fù)合物，這對于誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)位至關(guān)重要。。此外，caspase-8的生化形式在兩種途徑中不同。對于死亡途徑，caspase-8酶原被切割成亞基，其組裝形成成熟的，高活性的半胱天冬酶異四聚體，而對于激活途徑，酶原似乎保持完整，可能限制其蛋白水解功能但增強(qiáng)其作為銜接子的能力蛋白。
研究應(yīng)用[8]
Ac-IETD-pNA (Caspase 8顯色底物)可用于研究Caspase8在實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡中作用的研究。
Caspase8表達(dá)對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumornecrosisfactorrelatedapop-tosisinducingligand,TRAIL)誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)細(xì)胞株SH-SY5Y(SY5Y)細(xì)胞凋亡的影響及其發(fā)生機(jī)制。方法應(yīng)用RT-PCR方法和免疫組化法檢測IFNγ作用前后SY5Y細(xì)胞Caspase8的表達(dá);應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法及流式細(xì)胞儀(FCM)檢測IFNγ、TRAIL、IFNγ+TRAIL及IFNγ+Cas-pase8抑制劑+TRAIL對SY5Y細(xì)胞生長及凋亡的影響。
結(jié)果SY5Y細(xì)胞不表達(dá)Caspase8,IFNγ作用48h后的SY5Y細(xì)胞Caspase8表達(dá)明顯增加;SY5Y細(xì)胞對TRAIL不敏感,經(jīng)IFNγ誘導(dǎo)表達(dá)Caspase8的SY5Y細(xì)胞對TRAIL敏感,且與TRAIL濃度有關(guān),Caspase8抑制劑可明顯降低TRAIL對表達(dá)Caspase8的SY5Y細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)論IFNγ通過誘導(dǎo)Caspase8表達(dá)而逆轉(zhuǎn)SY5Y細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的耐受。
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