背景^[1-5]

TMB是用于免疫組織化學(xué)染色程序的生色底物，以及用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）的可視化試劑。TMB是白色結(jié)晶粉末，在與乙酸乙酯的溶液中形成淡藍(lán)綠色液體。TMB因陽(yáng)光和熒光燈而退化。TMB可以作為氫供體，通過(guò)過(guò)氧化物酶如辣根過(guò)氧化物酶將過(guò)氧化氫還原成水。TMB的氧化顯示3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化成3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺二亞胺得到的二亞胺使溶液呈現(xiàn)藍(lán)色，并且可以在分光光度計(jì)上以370和650nm的波長(zhǎng)讀取該顏色變化。

通過(guò)加入酸或另一種終止試劑可以停止反應(yīng)。使用硫酸使TMB變黃?？梢栽?50nm處讀取顏色。于它是光敏的，TMB應(yīng)避免陽(yáng)光直射。目前還不知道如果TMB是致癌和證據(jù)是矛盾的：TMB不是通過(guò)誘變Ames試驗(yàn)和不誘導(dǎo)在24單臂研究腫瘤形成的老鼠。根據(jù)該證據(jù)，它已被用作替代致癌化合物，如聯(lián)苯胺和鄰苯二胺。TMB已在逐步取代強(qiáng)致癌物聯(lián)苯胺和其他致癌性的聯(lián)苯胺衍生物，應(yīng)用于臨床化驗(yàn)、法醫(yī)檢驗(yàn)、刑事偵破及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域；尤其是在臨床生化檢驗(yàn)方面，TMB作為過(guò)氧化酶的新底物，在酶免疫分析法（EIA）和酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)法（ELISA）中獲得了廣泛的應(yīng)用。

研究應(yīng)用^[6][7][8]

1.用于ELISA測(cè)定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究

通過(guò)對(duì)間接酶聯(lián)免疫測(cè)定中顯色體系的各影響因素的研究,確定了酶聯(lián)免疫測(cè)定的顯色體系為二甲基亞砜(DMSO)配制四甲基聯(lián)苯胺(TMB)濃度為0.3 mg/mL的溶液為A液,pH5.5,0.2 mol/L磷酸氫二鈉與0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制過(guò)氧化脲素濃度為0.74 mg/mL的溶液為B液,兩者按一定比例混合后使用。試驗(yàn)結(jié)果表明,此顯色體系在25-40℃內(nèi)進(jìn)行都可得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果,且A、B液混合后在室溫下放置4 h仍可使用。A液及B液分別在4℃放置60 d后混合使用仍不影響測(cè)定結(jié)果。

2.用于優(yōu)化ELISA檢測(cè)中TMB/HRP顯色體系的研究

優(yōu)化TMB/HPR顯色系統(tǒng)的反應(yīng)參數(shù)。方法:首先采用單因素試驗(yàn),研究顯色體系中的緩沖溶液pH、TMB濃度、H2O2濃度、反應(yīng)時(shí)間和溫度對(duì)顯色的影響,在此基礎(chǔ)上,再進(jìn)行5因素4水平的正交試驗(yàn)。結(jié)果:TMB/HRP體系的工作條件:緩沖液pH為5.0,TMB濃度為2.5mg/ml,H2O2濃度為0.03%(V/V),反應(yīng)溫度為30～50℃,反應(yīng)時(shí)間為10min。結(jié)論:優(yōu)化的TMB/HRP反應(yīng)條件,可以滿足一般反應(yīng)的要求,所建立的TMB/HRP體系的優(yōu)化方法也適用于其它ELISA顯色系統(tǒng)的優(yōu)化。

3.3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺-H2O2-辣根過(guò)氧化物酶伏安酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定人血清免疫球蛋白E

建立了一種與TMB-H2O2-HRP聯(lián)用的IgE抗體鑒別脈沖伏定免疫分析法。HRP催化H2O2與TMB氧化產(chǎn)生的酶促反應(yīng)產(chǎn)物在pH4.0磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中，在0.10V(vs.Ag/AgCl)下表現(xiàn)出靈敏的伏安-ric反應(yīng)。本方法對(duì)IgE抗體的檢測(cè)限為4.0IU/mL，比傳統(tǒng)的分光光度ELISA法低4倍。

參考文獻(xiàn)

[1] Martin TL;Mufson EJ;Mesulam MM(1984)."The light side of horseradish peroxidase histochemistry".J Histochem Cytochem.32(7):793.

[2] Holland VR;Saunders BC;Rose FL;Walpole AL(1974)."A safer substitute for benzidine in the detection of blood".Tetrahedron.30(18):3299.

[3] Ashby J;Paton D;Lefevre PA;Styles JA;Rose FL(1982)."Evaluation of two suggested methods of deactivating organic carcinogens by molecular modification".Carcinogenesis.3(11):1277–1282.

[4] Chung K-T;Chen S-C;Wong TY;Li YS;Wei CI;Chou MW(2000)."Mutagenicity studies of benzidine and its analogs:Structure-activity relationships".Toxicol Sci.56(2):351–356.

[5] Chung K-T;Chen S-C;Claxton LD(2006)."Review of the Salmonella typhimurium mutagenicity of benzidine,benzidine analogues,and benzidine-based dyes".Mutation Research/Reviews in Mutation Research.612(1):58–76.

[6] 3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺-H2O2-辣根過(guò)氧化物酶伏安酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定人血清免疫球蛋白E[J].何亞楠,陳洪淵.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào).1997(08)

[7] ELISA測(cè)定中TMB顯色體系的優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究[J].李紅梅,陳佳,徐斐,曹慧,Maria Eugenia.生物技術(shù)通報(bào).2010(02)

[8] 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)三種底物的比較試驗(yàn)[J].張喜悅,徐天剛,王志亮,吳延功,王君瑋,趙云玲,徐培蓮.中國(guó)動(dòng)物檢疫.2003(11)