純化過程^[1]

為了大量獲得融合 His Tag 的重組蛋白質(zhì)用于開發(fā)高效實用的復(fù)性方法，本利用 PCR 技術(shù)體外擴(kuò)增了大腸桿菌 DH5α 染色體 DNA 中的蘋果酸脫氫酶的編碼基因、質(zhì)粒 pEGFP-C1 中的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的目標(biāo)基因以及牛胰腺全 DNA組中的核糖核酸酶 A 的 DNA，并通過 Bam HI 與 HindIII 酶切位點將其與質(zhì)粒載體 p ET28a 連接，構(gòu)建出 p ET28a 的重組質(zhì)粒（p ET28a-MDH，pET28a-EGFP 和pET28a-RNase A）。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 E.coli BL21（DE3）中，分別得到可以啟動T7 promoter 表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)（MDH 和 EGFP）的基因工程菌（a MN3 和 a EN5）。通過對表達(dá)菌培養(yǎng)時間、誘導(dǎo)時機(jī)等條件的優(yōu)化，得到表達(dá)菌 a MN3 的誘導(dǎo)條件：菌體 37℃培養(yǎng) 4h 后加入 1mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo) 9h；表達(dá)菌 a EN5誘導(dǎo)條件：菌體 37℃培養(yǎng) 4h 后加入 1mmol/L  IPTG，37℃誘導(dǎo) 3h。

對表達(dá)產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，高效表達(dá)的目標(biāo)蛋白產(chǎn)物（MDH 和 EGFP）在菌體內(nèi)主要以包涵體形式存在，但也有部分可溶蛋白表達(dá)。經(jīng) SDS-PAGE 凝膠電泳膠密度面積掃描分析得到 MDH 占全菌蛋白的 63.0％，EGFP 占全菌蛋白的 49.7％，包涵體蛋白的產(chǎn)量分別為 153.3 mg/(L 培養(yǎng)液)和 140.3mg/(L 培養(yǎng)液)。

親和分離^[1]

由于表達(dá)產(chǎn)物帶有 6 個His  Tag，因此利用固定化金屬親和色譜（Chelating SepharoseTM  Fast  Flow）對表達(dá)產(chǎn)物（MDH和EGFP）進(jìn)行了親和分離和復(fù)性的前期探索性實驗。結(jié)果表明，固定化金屬親和色譜能夠較好的吸附可溶性表達(dá)蛋白質(zhì)和經(jīng)脲變性的包涵體蛋白質(zhì)，并可被結(jié)合/洗脫緩沖液 (PH 8.0)洗脫緩沖液有效洗脫，得到了較好的分離純化效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 融合 His Tag 重組蛋白的基因克隆、表達(dá)及親和純化