背景及概述^[1][2]

竹黃是我國傳統(tǒng)的藥用真菌，具有止咳祛痛、舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)利濕、補(bǔ)中益氣、活血補(bǔ)血和散瘀通經(jīng)等功效。竹黃次生代謝產(chǎn)物中竹紅菌素和痂囊腔菌素含量較高，竹紅菌素包括竹紅菌甲素、竹紅菌乙素、竹紅菌丙素、竹紅菌丁素，痂囊腔菌素包括痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C、痂囊腔菌素D，都屬于苝醌類化合物。苝醌類化合物作為良好的光敏劑,具有不同程度的抗癌活性和抑制病毒活性，其中竹黃固態(tài)發(fā)酵料中竹紅菌甲素含量最多。竹紅菌甲素是目前已知可見光區(qū)內(nèi)優(yōu)良光敏劑，光敏可產(chǎn)生單重態(tài)氧，在無氧條件下可產(chǎn)生半醌負(fù)離子，對有機(jī)體、細(xì)胞和病毒具有傷害能力，都是非常具有開發(fā)價(jià)值的天然藥物。

竹紅菌甲素(HypocrellinA，簡稱HA)具有光敏產(chǎn)生各種活性氧的能力。與目前已經(jīng)商品化的光敏劑(如血卟啉類衍生物)相比，其具有易得、易純化、化學(xué)修飾性好、三重態(tài)量子產(chǎn)率高、單重態(tài)氧量子產(chǎn)率高、光毒性高、體內(nèi)代謝快等優(yōu)點(diǎn)，在光動力抗艾滋病毒、治療腫瘤和微血管類疾病等方面有廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。

理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)^[1]

竹紅菌甲素是提取自天然微生物真菌竹紅菌，竹細(xì)菌是屬于子束菌綱、肉座菌科、亞肉座菌屬的真菌，為我國特有野生資源。已知，竹紅菌甲素是一種天然有機(jī)色素，具有光敏性質(zhì)；其標(biāo)準(zhǔn)品的理化性質(zhì)：紅色晶體，無臭，無味，純度98％，熔點(diǎn)209-210℃，易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯，溶于甲醇，乙醇，微溶于石油醚，不溶于水，不易發(fā)生水解作用，但在堿性環(huán)境中可自敏光氧化發(fā)生光解作用；現(xiàn)在民間用作藥物治療胃痛和關(guān)節(jié)炎并且是治療皮膚病、抗腫瘤、抗艾滋病的潛在的有效光敏藥物。

竹紅菌甲素是分布于我國云南麗江這一特定地域的竹紅菌的主要成分，它的醇溶液顯鮮紅色，在紫外燈下觀察顯櫻紅色熒光，在堿溶液中顏色由紅變綠。作為一種重要的天然光敏色素，竹紅菌甲素在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域有著巨大地潛在應(yīng)用價(jià)值。

竹紅菌甲素采用熱板法和扭體法對小鼠進(jìn)行鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)，用大鼠足癰腫脹法和小鼠耳腫脹法進(jìn)行抗炎實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均表明竹黃中的主要活性成分竹紅菌甲素具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛的功效。這為臨床用于治療胃氣痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷以及坐骨神經(jīng)痛等疾病提供了藥理基礎(chǔ)，這也是我國民間用于治療類似疾病取得較好療效的原因所在。

竹紅菌甲素作為一種光動力學(xué)物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗菌活性。萬象義等用紙片法對竹紅菌甲素進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明竹紅菌甲素在光照下可以抑制某些微生物優(yōu)其是革蘭氏陽性菌)的生長，不同光源、不同光照強(qiáng)度對其抑菌強(qiáng)度均有影響。松枝澄等則認(rèn)為竹黃的一些活性成分(竹紅菌甲素)可以作為植物素抑制某些菌類的代謝.其中機(jī)理可能與細(xì)胞類脂過氧化機(jī)制有關(guān)。

應(yīng)用^[3]

竹紅菌甲素是竹紅菌和竹黃菌中主要活性成分，就是竹黃的紅色色素部分，可溶于丙酮、乙醇和氯仿等有機(jī)溶劑，色澤鮮紅且富有保健功能，所以它作為一種脂溶性食品添加劑(食用色素)，具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和廣闊的應(yīng)用前景。寇嫻等對市售竹黃浸泡液利用制備性薄層層析、重結(jié)晶等技術(shù)進(jìn)行紅色素的提取與鑒定，并對成色物質(zhì)竹紅菌甲素和竹紅菌乙素進(jìn)行了熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性的研究，認(rèn)為它能在酸性至pH8.2范圍內(nèi)保持鮮紅的色澤，且具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。廣泛地在醫(yī)藥、食品、農(nóng)藥等領(lǐng)域得到應(yīng)用，造福人類。

制備^[2]

高純度竹紅菌甲素(Hypocrellin A)的分離、提取制備方法按以下步驟提取：

1)粗提：以竹紅菌藥材為原料，將竹紅菌藥材粉碎成粗粉；加2～10倍量75％～95％乙醇熱回流0.5～4小時(shí)，放冷至室溫，傾出上清夜，藥渣重復(fù)上述回流提取2次，合并前后3次的乙醇提取溶液。

2)濃縮、自然結(jié)晶：將乙醇提取液分別轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，減壓濃縮回收乙醇至原體積的2/3時(shí)，室溫靜置，使其自然結(jié)晶。

3)重結(jié)晶：傾去母液，加乙醇(或丙酮)將結(jié)晶溶解后，室溫靜置使其重結(jié)晶。

4)精洗：結(jié)晶的晶體用20～80℃的純化水按1∶5～1∶20比例洗滌3次；棄上清液，盡量傾干水份；

5)再用20～80℃的60～90石油醚洗滌，直至石油醚溶液基本無色，真空干燥即得純品，純度大于95％。

將上述高效液相色譜(HPLC)分析：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈∶甲醇∶2％醋酸(9∶2∶1)為流動相；檢測波長為465nm，流速為0.8ml/min；柱溫為25℃；進(jìn)行含量測定，結(jié)果見圖：

竹紅菌甲素可用于制成軟膏劑、酊劑、氣霧劑、片劑、膠囊劑和注射劑等多種劑型，以及食品添加劑等，應(yīng)用范圍廣泛。

方法二：

竹黃固態(tài)發(fā)酵料的獲得：

1、菌株來源：竹黃菌來源于中國林業(yè)微生物保藏管理中心，Shiraiasp.cfcc84681。該菌株采用真菌常用培養(yǎng)基PDA斜面保藏，使用時(shí)活化菌株。

2、制備種子接種液：采用培養(yǎng)基配方：葡萄糖1％、硝酸鈉0.2％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂0.03％。配置10瓶，每瓶100mL，滅菌。每瓶接入活化菌株一個菌塊，28℃搖瓶發(fā)酵3d。

3、制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取大米2000g，用水浸泡一夜，瀝干裝入滅菌袋高溫高壓滅菌。固體發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基制備：葡萄糖2％、硝酸鈉0.4％、磷酸二氫鉀0.1％、硫酸鎂0.06％。每瓶50mL，滅菌。

4、固態(tài)發(fā)酵：將制備的種子液接入大米培養(yǎng)基中，置28℃恒溫箱中發(fā)酵，發(fā)酵第7d時(shí)，添加補(bǔ)料培養(yǎng)基每200g加50mL繼續(xù)發(fā)酵，18d發(fā)酵結(jié)束。

5、烘干：將(4)中得到的固態(tài)發(fā)酵料放置在烘箱中，60℃烘96h。粉碎，過20目篩得到固態(tài)發(fā)酵料1811g。

6、稱取浸提：

將得到固態(tài)發(fā)酵料粉碎，稱取1500g，首先加入2000mL石油醚，浸泡1.5h后，抽濾得到石油醚浸提液，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到石油醚浸膏，重復(fù)5次，得到石油醚合并浸膏3.2g。然后向抽濾后的固態(tài)發(fā)酵料加入2000mL乙酸乙酯，浸泡1.5h后，抽濾得到乙酸乙酯浸提液，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到乙酸乙酯浸膏，重復(fù)5次，得到乙酸乙酯合并浸膏5.2g。最后向上一次抽濾后的固態(tài)發(fā)酵料加入2000mL乙醇，浸泡1.5h后，抽濾得到乙醇浸提液，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到乙醇浸膏，重復(fù)5次，得到乙醇合并浸膏2.3g。

7、石油醚浸膏中竹紅菌甲素層析液的獲得：

將步驟1中的石油醚浸膏3.2g進(jìn)行下列操作，使用250g200～300目的柱層析硅膠，加壓0.1Mpa，首先使用純石油醚2L洗脫液洗去填料一些雜質(zhì)，然后開始分批注入不同配比的洗脫液，即層次的洗脫液和第二層次的洗脫液進(jìn)行洗脫，依次收集洗脫液，每500mL收集一次，采用石油醚和乙酸乙酯的4個不同的體積比依次進(jìn)行洗脫。層次的洗脫液具體的配比范圍是石油醚：乙酸乙酯(100:20)2L，石油醚：乙酸乙酯(100:21)2L，石油醚：乙酸乙酯(100:22)2L，石油醚：乙酸乙酯(100:23)2L，上述配比的洗脫液進(jìn)行洗脫后依次收集層析液，每次收集500mL，在每次收集的層析液中取1mL，然后通過HPLC檢測，檢測將竹紅菌甲素的含量高于65％的進(jìn)行合并以用于結(jié)晶。

8、竹紅菌甲素和痂囊腔菌素A的濃縮結(jié)晶：

把含量65％以上的同種物質(zhì)進(jìn)行合并，并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋干得到層析液浸膏，得到的浸膏使用乙酸乙酯分別將竹紅菌甲素和痂囊腔菌素浸膏充分溶解，室溫靜止蒸發(fā)，待乙酸乙酯快蒸發(fā)干時(shí)用石油醚沖洗5遍得到結(jié)晶。石油醚浸膏獲得的竹紅菌甲素結(jié)晶0.32g，乙酸乙酯浸膏獲得的竹紅菌甲素結(jié)晶0.155g；乙醇浸膏獲得的竹紅菌甲素結(jié)晶0.124g。

主要參考資料

[1]萬象義, & 陳遠(yuǎn)騰. (1980). 一種新的光化學(xué)療法藥物——竹紅菌甲素. 科學(xué)通報(bào), 25(24), 1148-1149.

[2]張曼華, 安靜儀, 倪志杰, & 蔣麗金. (1984). 竹紅菌甲素的光化學(xué)——竹紅菌甲素自敏光氧化反應(yīng)的研究. 科學(xué)通報(bào), 29(18), 1117-1117.

[3]林海萍, 陳虹, 葉勇, & 吳林森. (2002). 竹黃竹紅菌甲素含量測定方法. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 19(2), 157-160.