背景及概述[1][2]
連翹酯苷A對(duì)金黃色葡萄球菌等 11種致病菌均有極強(qiáng)的抑制作用，并具有抗病毒、抗炎、解熱、抗氧化等作用，是迄今為止從連翹中發(fā)現(xiàn)的藥理活性最強(qiáng)的活性成分之一。連翹為木犀科植物連翹的干燥果實(shí)，按采收期的不同可分為青翹和老翹。具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效，主治癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風(fēng)熱感冒、高熱煩渴、熱淋尿閉等癥。連翹主要含苯乙醇苷類、木脂素及其苷類、五環(huán)三萜類、揮發(fā)油類等化合物。
現(xiàn)代藥理研究證明具有抗菌、抗炎、解熱等作用。同一產(chǎn)地不同批次的連翹藥材中連翹酯苷 A含量差異較大。將藥材的外觀、形態(tài)等因素與含量進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)是藥材的成熟度和采收時(shí)間對(duì)連翹酯苷 A含量有較大影響。當(dāng)連翹酯苷A含量較高時(shí)，藥材顏色一般較深，為成熟度較低即采收時(shí)間較早的藥材，而藥材顏色越淺即成熟度越高(俗稱老翹) 時(shí)，連翹酯苷A含量則越低，因此選擇連翹藥材時(shí)，應(yīng)注意成熟度和采收時(shí)間對(duì)于連翹藥材質(zhì)量的影響。
制備[3]
CN201410149031.3提供一種產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌，所述的連翹內(nèi)生真菌為枝狀枝孢 (Cladosporium cladosporioides)，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期：2014年1月15日，保藏編號(hào)： CGMCC No.8728。
CN201410149031.3提供一種產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌的應(yīng)用，具體的，連翹內(nèi)生真菌在生產(chǎn)藥物活性成分(連翹脂苷A、B和連翹苷)中的應(yīng)用，包括以下步驟：取連翹內(nèi)生真菌(CGMCC No.8728)發(fā)酵培養(yǎng)液，分離藥物活性成分即可。更具體的，連翹內(nèi)生真菌在制備藥物中的應(yīng)用，包括以下步驟：取連翹內(nèi)生真菌(CGMCC No.8728)發(fā)酵培養(yǎng)液，分離藥物活性成分，與輔料混合即可。所述的藥物活性成分為連翹脂苷A、連翹脂苷B和連翹苷，經(jīng)分離、純化后，可以按照常規(guī)方法制備成片劑、顆粒劑、粉劑、注射液、口服液、脂質(zhì)體等劑型。所述的輔料為醫(yī)藥、農(nóng)藥領(lǐng)域常規(guī)輔料。當(dāng)制備成注射液時(shí)，輔料可采用甘露醇、葡萄糖、山梨醇等，片劑時(shí)采用淀粉、羧甲基淀粉鈉、微晶纖維素等；口服液時(shí)采用油性基質(zhì)如脂肪酸、脂肪酸甘油酯等。所述發(fā)酵培養(yǎng)液的制備方法為：取經(jīng)活化的連翹內(nèi)生真菌置于PDB培養(yǎng)基中，在27 ～29℃下震蕩培養(yǎng)4～7天即可。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明中連翹內(nèi)生真菌為枝孢菌黑霉菌(Cladosporium cladosporioides)，從河南省洛陽(yáng)市周山風(fēng)景區(qū)的連翹活體中分離得到，屬于一種共生微生物，可以代謝產(chǎn)生與連 翹成分相同的成分，具有很強(qiáng)的殺滅和抑制細(xì)菌的作用，發(fā)酵培養(yǎng)后能夠產(chǎn)生對(duì)致病性大腸桿菌(E.coli K99，ATCC hb-8178))、沙門氏菌(Salmonella.Typhimurium，ATCC14028)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus，ATCC29213)等有抑制作用的活性代謝產(chǎn)物，包括連翹脂苷A、B和連翹苷等，是醫(yī)藥行業(yè)重要的微生物資源。
藥理研究[2]
P-gp是一種相對(duì)分子質(zhì)量170 kDa 的跨膜糖蛋白，主要分布于細(xì)胞膜上， 是 ABC-B1 基因( MDRl)編碼產(chǎn)物。早期 P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及其抑制劑的研究較多，現(xiàn)已拓展為研究新藥篩選、新藥評(píng)價(jià)和藥物相互作用( drug-drug interaction， DDI) 等方面，Zhang等研究附子-甘草藥對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有P-gp 抑制劑存在時(shí)，主要有效成分在體內(nèi)濃度顯著增高。提示基于藥物對(duì)P-gp 的作用是研究中藥聯(lián)用規(guī)律的發(fā)展趨勢(shì)。Rh- 123是經(jīng)典的 P-gp 功能探針?biāo)幬?，可用于快速檢測(cè)藥物是否為 P-gp 的底物或抑制劑。孟祥樂(lè)等人以Rh-123 為探針底物，檢測(cè)連翹酯苷對(duì) P-gp 的外排作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度連翹脂苷 A 均可抑制 P-gp對(duì)Rh- 123 的外排，對(duì)P-gp 有一定抑制作用，且與濃度呈正相關(guān)。證實(shí)連翹脂苷 A 是 P-gp 的抑制劑。這可能是連翹脂苷 A 增加金銀花中咖啡酰類成分吸收的主要原因。P-gp 作為一種能量依賴性藥物外排泵，P-gp 外排的機(jī)制為P-gp底物可通過(guò)和其中的氨基酸位點(diǎn)結(jié)合，激活 P-gp ATP 酶，釋放出 ATP 分子，導(dǎo)致藥物結(jié)合口袋周圍 TM 域(如 TM1 和 TM2) 的重排，引起藥物的外排。P-gp 抑制劑主要通過(guò)抑制P-gpATP 酶，降低 P-gp 對(duì)藥物外排，增加藥物的吸收。通過(guò)觀察連翹脂苷A對(duì) P-gp ATP 酶活性發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度連翹脂苷 A對(duì) P-gp ATP 酶活性均有抑制作用，但抑制作用與濃度呈反比，質(zhì)量濃度越低，抑制P-gp ATP酶的作用越強(qiáng)。通過(guò)研究連翹脂苷 A 對(duì) P-gp 外排功能發(fā)現(xiàn)，連翹脂苷 A 主要是通過(guò)抑制 P-gp ATP 酶活性，對(duì) P-gp的外排有抑制作用，從而減少對(duì)咖啡酰類藥物的外排，增加后者在體內(nèi)吸收。該結(jié)果從分子學(xué)角度提示金銀花-連翹藥對(duì)聯(lián)用增效的機(jī)制與 P-gp 蛋白外排功能有關(guān)，且二者在量的配比上非常重要。
主要參考資料
[1]姜艷艷,石任兵,劉斌,劉洋,梁兆昌,王帥.RP-HPLC法測(cè)定連翹中連翹脂苷A的含量[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,32(08):565-567+570.
[2]孟祥樂(lè),郭艷麗,蘇成福,黃海英,桂新景,李學(xué)林.連翹脂苷A抑制Caco-2細(xì)胞膜上P-糖蛋白的外排功能及作用機(jī)制探討[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015,21(17):5-8.
[3] CN201410149031.3 一種產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌及其應(yīng)用