背景^[1-3]

細(xì)胞侵襲叫做細(xì)胞爬行，細(xì)胞移動(dòng)或者細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，是細(xì)胞在化學(xué)信號(hào)（如：趨化因子）的驅(qū)使下沿著濃度梯度從一個(gè)區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一區(qū)域的運(yùn)動(dòng)，是活細(xì)胞普遍存在的一種運(yùn)動(dòng)形式。細(xì)胞遷移在損傷修復(fù)，細(xì)胞分化，胚胎發(fā)育，腫瘤轉(zhuǎn)移等生理病理過(guò)程中普遍存在。

細(xì)胞侵襲與細(xì)胞遷移比較類似，但是“侵襲”需要細(xì)胞穿過(guò)胞外基質(zhì)層（ECM）或基底膜基質(zhì)層（BME），在這個(gè)過(guò)程中細(xì)胞先酶解去除ECM/BME的阻礙，從而在趨化因子濃度梯度的驅(qū)使下完成從一處到另一處的移動(dòng)。常用來(lái)評(píng)估腫瘤細(xì)胞在正常組織中轉(zhuǎn)移的能力，但正常細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞也有相同的能力。

細(xì)胞侵襲

細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用于各種細(xì)胞因子對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及一些抑制血管生成的新藥研究。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲能力最常用的實(shí)驗(yàn)方法，其原理是用一層聚碳酸酯膜將高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開，細(xì)胞接種到低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里，通常膜孔都被Matrigel覆蓋，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞必須分泌水解酶并通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)才能穿過(guò)鋪有Matrigel的濾膜，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：

1、ECM Gel原液提前1h放在4℃冰箱中解凍，實(shí)驗(yàn)前轉(zhuǎn)移到冰盒中。

2、將1.5 mL EP管、槍頭和細(xì)胞小室（已先行放入孔板中），置于冰上預(yù)冷。

3、根據(jù)自己的使用量，按照ECM Gel:無(wú)血清培養(yǎng)基=1:7.5在冰上稀釋成使用液。

4、把槍頭剪去一小段（約3μm）后在冰上吸取40μL/孔ECM Gel使用液輕輕加入小室的上室中，加入時(shí)慢慢移動(dòng)槍頭，保證液體平鋪在底部。

5、放在37℃孵箱15min，讓膠凝固。

6、消化、離心、計(jì)數(shù)細(xì)胞后，按照2.5x104/mL用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液（如果細(xì)胞很多，這一步可以提前，在4、5之前做）。

7、按照每孔200μL，將細(xì)胞懸液加入上室，同時(shí)在下室加入10%FBS+培養(yǎng)基500μL，放入37℃孵箱培養(yǎng)。

8、若干小時(shí)后取出，吸去上室多余液體，用PBS清洗兩次，用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，吸干水分并擦去膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞。

9、在上室中加入結(jié)晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水緩緩沖去染液，再次用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，吸干水分。

10、在正置顯微鏡上放置一塊載玻片，將細(xì)胞小室倒置放在上面，拍照。

11、在100倍視野下，對(duì)膜的上下左右及中間計(jì)數(shù)，做平均數(shù)。

應(yīng)用^[4][5]

細(xì)胞侵襲可以用于TAB182通過(guò)EGFR信號(hào)通路調(diào)控人肺癌細(xì)胞EMT及侵襲遷移

通過(guò)構(gòu)建TAB182低表達(dá)人肺癌細(xì)胞株,開展以下三項(xiàng)工作:(1)探究TAB182對(duì)DNA損傷應(yīng)答蛋白的表達(dá)調(diào)控;(2)探究TAB182對(duì)肺癌細(xì)胞EGFR的作用及機(jī)制;(3)闡明TAB182通過(guò)EGFR信號(hào)通路調(diào)控肺癌細(xì)胞EMT及侵襲遷移。

方法:(1)建立shRNA介導(dǎo)的TAB182穩(wěn)定敲低肺癌細(xì)胞株:用慢病毒顆粒感染A549和H1299肺癌細(xì)胞后,先用熒光顯微鏡觀察GFP信號(hào)以驗(yàn)證感染效率,然后驗(yàn)證TAB182 mRNA及蛋白敲降效果。其中,Control-shRNA為TAB182正常表達(dá)細(xì)胞(下稱對(duì)照細(xì)胞),TAB182-shRNA#1和TAB182-shRNA#2為TAB182敲降細(xì)胞。

(2) 驗(yàn)證TAB182參與DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù):用4Gy 60Coγ射線單次照射A549-TAB182低表達(dá)細(xì)胞株(下文默認(rèn)照射方式為60Coγ射線單次照射),在照后0 h、1 h、2 h和4 h檢測(cè)DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γ-H2AX水平變化;驗(yàn)證HUWE1-shRNA敲低表達(dá)的Hela細(xì)胞株的HUWE1敲降效率,并在10Gy照后24 h內(nèi)觀察γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量變化。

(3) 探究TAB182對(duì)DNA損傷應(yīng)答蛋白的表達(dá)影響:分析A549和H1299-TAB182低表達(dá)細(xì)胞株中ATM、DNA-PKcs、Ku86、Ku70、Ct IP、EGFR、p21和p16蛋白水平改變。

(4) 探究TAB182對(duì)肺癌細(xì)胞EGFR信號(hào)的影響:分析A549-TAB182低表達(dá)細(xì)胞株中EGFR mRNA及蛋白水平。

(5) 探究TAB182對(duì)肺癌細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)影響:檢測(cè)A549-TAB182低表達(dá)細(xì)胞株中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、Snail蛋白水平變化。

(6) 驗(yàn)證EGFR過(guò)表質(zhì)粒效果:將EGFR過(guò)表質(zhì)粒轉(zhuǎn)入普通A549細(xì)胞中24 h后,分析EGFR、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和α-SMA表達(dá)變化。

(7) 探究EGFR是否介導(dǎo)TAB182調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞EMT:將EGFR過(guò)表質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A549-TAB182低表達(dá)細(xì)胞株后24 h,檢測(cè)EGFR、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和MMP-2表達(dá)改變。

(8) 驗(yàn)證EGFR蛋白的放射響應(yīng)性:在4Gy照射普通A549細(xì)胞后1d和4 d,分析EGFR表達(dá)改變。

(9) 探究放射應(yīng)答蛋白EGFR的劑量依賴性:在0.5、1、2、4、6、8、10Gy照射普通A549細(xì)胞后第7 d,檢測(cè)EGFR表達(dá)變化。

(10) 驗(yàn)證TAB182蛋白的放射響應(yīng)性:在4Gy照射A549-TAB182低表達(dá)細(xì)胞株后第3 d,分析TAB182表達(dá)改變。

(11) 在照射條件下探究TAB182對(duì)肺癌細(xì)胞EGFR信號(hào)及EMT表型的影響:在4Gy照射A549-TAB182低表達(dá)細(xì)胞株后0 h、24 h、48 h和7 d,檢測(cè)EGFR及EMT分子標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)變化。

(12) 探究TAB182是否影響放射致肺癌細(xì)胞侵襲活性增強(qiáng):在4Gy照射A549-TAB182低表達(dá)細(xì)胞株后第7 d,通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞侵襲活性。

(13) 探究TAB182對(duì)肺癌細(xì)胞EGFR蛋白穩(wěn)定性的影響:在10μg/m L放線菌酮(CHX)處理A549-TAB182低表達(dá)細(xì)胞株后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24h,通過(guò)Western Blotting分析EGFR蛋白水平下降速率;為了在照射條件下研究EGFR穩(wěn)定性,先用CHX預(yù)處理A549-TAB182低表達(dá)細(xì)胞株,然后在4Gy照后不同時(shí)間點(diǎn)分析EGFR蛋白水平變化。

(14) 探究TAB182對(duì)各類肺癌細(xì)胞表型的影響:在A549-TAB182低表達(dá)細(xì)胞株中,通過(guò)CCK-8活力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性;通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力;通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)體外侵襲活性。

(15) 探究EGFR是否介導(dǎo)TAB182調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞侵襲遷移:將EGFR過(guò)表質(zhì)粒轉(zhuǎn)入TAB182敲降肺癌細(xì)胞后24 h,通過(guò)Transwell遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞侵襲及遷移活性。

參考文獻(xiàn)

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