背景[1-3]
細胞遷移指即細胞劃痕法，是測定細胞遷移運動與修復能力的方法，類似體外傷口愈合模型。在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細胞上，用微量槍頭或其他硬物在細胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞至實驗設定的時間，取出細胞培養(yǎng)板，觀察周邊細胞是否生長至中央劃痕區(qū)，以此判斷細胞的生長遷移能力，實驗通常需設定正常對照組和實驗組，實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等組別，通過不同分組之間的細胞對于劃痕區(qū)的修復能力，可以判斷各組細胞的遷移與修復能力。
當細胞長到融合成單層狀態(tài)時，在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕”。劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域使“劃痕”愈合。
細胞遷移
實驗方法
1、培養(yǎng)板接種細胞之前先用marker筆在12孔板背面畫橫線標記（方便拍照時定位同一個視野）。
2、細胞消化后接入12孔板，數(shù)量以貼壁后鋪滿板底為宜（數(shù)量少時可培養(yǎng)一段時間至鋪滿板底）。
3、細胞鋪滿板底后，用1ml槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，盡量保證各個劃痕寬度一致。（人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實驗結果，這也是該方法的缺陷）。
4、吸去細胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板三次，洗去劃痕產(chǎn)生的細胞碎片。
5、加入無血清培養(yǎng)基，拍照記錄。
6、將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔4-6小時取出拍照。
7、根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實驗結果。
應用[4][5]
細胞遷移可以用于NFIC1抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲的分子機制的研究
探究了NFIC1對Luminal A型和三陰型乳腺癌轉移的影響和相關機制。本研究將NFIC1的過表達質粒和si RNA分別轉染入MCF7和MDA-MB-231細胞中,Wound healing和Transwell實驗結果顯示,過表達NFIC1能明顯抑制MCF7和MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲;敲低NFIC1能顯著促進MCF7和MDA-MB-231細胞的遷移能力和對Matrigel膠的侵襲能力。
為了探究NFIC1抑制遷移和侵襲的分子機制,我們在MCF7和MDA-MB-231細胞中分別瞬時過表達NFIC1后,對NFIC1過表達及其對照細胞進行了RNA測序。對MCF7細胞測序結果的分析發(fā)現(xiàn),對照組與過表達NFIC1組差異基因主要富集在由干擾素介導的Jak-STAT通路上。
隨后,我們證實了過表達NFIC1能促進IFNL1、IFNL2/3和IFNB1的表達和分泌,同時也能激活Jak-STAT通路。接下來,我們在過表達NFIC1后使用Jak-STAT通路抑制劑Filgotinib和Ruxolitinib來阻斷Jak-STAT通路,發(fā)現(xiàn)阻斷Jak-STAT通路能逆轉NFIC1抑制MCF7細胞遷移和侵襲的效果。
進一步根據(jù)測序結果,在過表達NFIC1的細胞中分別敲低Jak-STAT通路的下游靶基因MX1、MX2和RARRES3,發(fā)現(xiàn)敲低MX1和MX2能減弱NFIC1過表達對遷移和侵襲的抑制作用。最后,我們在過表達NFIC1同時分別敲低IFNL1、IFNL2/3和IFNB1,此時Jak-STAT通路受到明顯抑制、MX1和MX2的表達顯著降低、并且NFIC1抑制遷移和侵襲的作用也遭到削弱。
以上結果表明NFIC1在MCF7細胞中通過促進IFNL1、IFNL2、IFNL3和IFNB1的表達激活了Jak-STAT通路,活化的Jak-STAT通路通過上調(diào)MX1和MX2的表達來抑制MCF7細胞的遷移和侵襲。通過對MDA-MB-231細胞測序結果中差異表達基因的篩選及驗證,我們發(fā)現(xiàn)NFIC1能直接結合在S100A2啟動子區(qū)域從而上調(diào)S100A2的表達。
敲低S100A2能逆轉NFIC1對MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的抑制效果。隨后我們發(fā)現(xiàn)過表達NFIC1后MEK和ERK的磷酸化水平受到明顯的抑制,敲低S100A2能逆轉NFIC1對MEK/ERK通路的抑制狀態(tài)。進一步,在MDA-MB-231細胞中過表達NFIC1同時敲低S100A2后,使用U0126抑制MEK/ERK通路能解除敲低S100A2對遷移和侵襲的逆轉效果。
同時,過表達NFIC1上調(diào)S100A2后能通過抑制MEK/ERK通路來抑制MDA-MB-231細胞的上皮間充質轉化。以上結果表明NFIC1在MDA-MB-231細胞中通過上調(diào)S100A2的表達來抑制MEK/ERK通路,進而誘導MDA-MB-231細胞由間充質形態(tài)轉化為上皮形態(tài),最終抑制MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲。
參考文獻
[1]Sulforaphane suppresses metastasis of triple-negative breast cancer cells by targeting the RAF/MEK/ERK pathway.[J].Zhang Ying;Lu Qian;Li Nan;Xu Ming;Miyamoto Tatsuo;Liu Jing.NPJ breast cancer,2022(1)
[2]Transcriptional activation of S100A2 expression by HIF-1αvia binding to the hypomethylated hypoxia response elements in HCC cells.[J].Yan Jia;Huang Ya Jun;Huang Qing Yu;Liu Peng Xia;Wang Chang Shan.Molecular carcinogenesis,2022(5)
[3]Cancer statistics,2022[J].Siegel Rebecca L.;Miller Kimberly D.;Fuchs Hannah E.;Jemal Ahmedin.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2022(1)
[4]Kinesin family member 2C promotes hepatocellular carcinoma growth and metastasis via activating MEK/ERK pathway.[J].Ding Qian;Jiang Caihua;Zhou Yajing;Duan Jianping;Lai Jianming;Jiang Min;Lin Dongdong.Bioscience,biotechnology,and biochemistry,2021(11)
[5]張靜.NFIC1抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲的分子機制的研究[D].吉林大學,2022.