背景及概述

碘化丙啶是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，常用于細胞凋亡檢測，英文全稱是Propidium Iodide。它是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。

應用 ^[1-3]

一、用于制備快速檢測生物細胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒

目前測定活細胞數(shù)的方法有光學顯微鏡讀數(shù)計數(shù)法、平板涂布培養(yǎng)菌落計數(shù)法、光電比濁法、或然數(shù)法，以及膜過濾法等。顯微鏡直接計數(shù)法：將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計菌器），于顯微鏡下直接觀察計數(shù)。該方法簡便、快速、直觀，可以用于酵母、細菌、霉菌孢子和動物細胞等懸液的計數(shù)。缺點為不能準確識別細胞的死活狀態(tài)，所測得的結(jié)果通常是死細胞和活細胞的總和。

CN201310060140.3提供一種快速檢測生物細胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒及其應用，該試劑盒可以快速實時地觀察或者檢測樣品中各種細胞的活細胞與死細胞的數(shù)量，直觀簡便，排除了其它物質(zhì)的干擾和培養(yǎng)周期長的缺點，不僅適用于動物細胞，并且還適用于大部分的革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌。

本發(fā)明的一種快速檢測生物細胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒，所述試劑盒包括花青素染料和碘化丙啶染料，花青素染料的儲存濃度為5-6mM，碘化丙啶染料的儲存濃度為100 μg/mL。所述花青素染料所使用的稀釋緩沖液為1×TEbuffer[含1mMEDTA（乙二胺四乙酸）的 10mMTris-HCl（三羥甲基氨基甲烷-HCl）緩沖液，pH8.0]。這種染料能滲透到所有狀態(tài)下的細胞，它傾向于結(jié)合細胞內(nèi)雙鏈DNA，對于單鏈DNA和RNA的結(jié)合較少，對細胞的核酸進行染色，使細胞發(fā)出綠色熒光。

檢測步驟如下：在細胞懸液中加入試劑盒中的花青素染料和碘化丙啶，利用熒光顯微鏡觀察計數(shù)或者利用微孔 熒光讀板器在發(fā)射光波長下進行檢測，根據(jù)不同顏色熒光值的強弱反映生物樣品液中細胞的存活狀態(tài)。本發(fā)明可以快速實時地觀察或者檢測樣品中各種細胞的活細胞與死細胞的數(shù)量，直觀簡便。并且花青素染料來源于自然界，毒性低，便于使用。

由于染料只能專一性地結(jié)合在雙鏈 核酸上發(fā)出熒光，排除了其它物質(zhì)的干擾和培養(yǎng)周期長的缺點。此染色方法不僅適用于動物細胞，并且還適用于大部分的革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌。

二、用于制備精子活力快速檢測試劑盒

CN200710099772.5提供一種可以在家里即可操作、快速、使用方便、價格便宜，并且能診斷出有活力的精子的數(shù)量的精子活力快速檢測試劑盒。本發(fā)明包括精液收集盒、曲拉通X100溶液、碘化丙啶溶液、標準色卡和試驗板，所述的精液收集盒由塑料收集盒和精液液化劑組成，所述的試驗板包括外殼、基板，外殼和基板是長方形的PVC塑料制成，外殼中央有兩個試驗孔，所述基板上有吸水紙、過濾膜，吸水紙和過濾膜位于基板上方，外殼的兩個試驗孔下方；吸水紙位于過濾膜下方；標準色卡的顏色為經(jīng)顯微鏡計數(shù)確認的不同活力精子樣品分別加入活力為0.05-0.2％的曲拉通溶液和活力為0.01-0.5％碘化丙啶溶液試驗結(jié)果的顏色。

本發(fā)明的原理是：只有沒有活力的精子才會被碘化丙啶溶液染色，所以在試驗孔一被染色的精子全部為沒有活力的精子，而試驗孔二的精子經(jīng)過細胞表面活性劑曲拉通X-100溶液破壞后，全部變成沒有活力的精子，所以在試驗孔二被染色的精子為精子的總數(shù)量，把試驗孔一和試驗孔二的試驗結(jié)果分別與比色卡對比，得出沒有活力的精子的數(shù)量和精子的總數(shù)量，用精子的總數(shù)量減去沒有活力的精子的數(shù)量，即可得出有活力的精子的數(shù)量。

制備方法，包括如下步驟：

制備濃度為0.05-0.2％的曲拉通溶液：把曲拉通加入磷酸緩沖液充分溶解，過濾后置室溫保存；

制備濃度為0.01-0.5％碘化丙啶溶液：把碘化丙啶加入磷酸緩沖液充分溶解，過 濾后置室溫避光保存；

制備標準色卡：用經(jīng)過顯微鏡計數(shù)確認的500萬、1000萬、2000萬、3000萬、4000萬、5000萬、6000萬、7000萬、8000萬、9000萬、10000萬個/毫升精子樣品分別加入濃度為0.05-0.2％的曲拉通溶液和濃度為0.01-0.5％碘化丙啶溶液，根據(jù)試驗結(jié)果的顏色，制備出標準色卡；

將過濾膜和吸水紙依次置于基板上方，試驗孔下方。

本發(fā)明的優(yōu)點：能夠快速準確地檢測出精子的活力，即有活力的精子的數(shù)量，從而診斷出男性是否能夠生育后代，比以往傳統(tǒng)的診斷方法節(jié)省很多時間，使用簡單，在藥店購買、家庭使用即可，不用去醫(yī)院就診，使使用者沒有羞澀感，使夫妻可以提前知道自己的潛在的生育問題，使用本試劑盒還可以對男子絕育手術(shù)后效果進行檢測，也可用于精子庫對精子質(zhì)量進行篩選。

三、用于制備一種染色液

CN200710026446.1提供一種用于鑒別原蟲細胞活力的染色液，包括如下組分：0.05％-0.3％吖啶橙溶液3份；0.0067％-0.026％碘化丙啶溶液1份，所述吖啶橙溶液、碘化丙啶溶液是由0.38％NaCl 溶液或雙蒸水配制而成。

使用所述染色液鑒別原蟲細胞活力的方法，包括如下步驟：

(1)取材：提供原蟲細胞，備用；

(2)配制染色液：將0.05％-0.3％吖啶橙溶液和0.0067％-0.026％碘化丙啶溶液按3∶1混合，過濾備用；

(3)染色：將原蟲細胞涂片陰干，用步驟(2)提供的染色液染色，雙蒸水緩慢沖洗，干燥；

(4)鏡檢：于490nm激發(fā)濾光片和510nm光柵濾光片熒光顯微鏡下觀察；

(5)鑒別：根據(jù)鏡檢結(jié)果的顏色變化鑒別原蟲細胞活力。

本發(fā)明對鑒別家蠶微孢子蟲孢子的活性，具有快捷、靈敏、準確、直觀的特點，克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足。鑒于家蠶微粒子病長期嚴重威脅蠶種生產(chǎn)，采用本發(fā)明鑒別家蠶微孢子蟲的活力技術(shù)，對蠶業(yè)生產(chǎn)有重大的生產(chǎn)應用價值，對進一步深入研究家蠶微粒子蟲的傳染規(guī)律、微粒子病的發(fā)病規(guī)律、微粒子病防治技術(shù)、微孢子蟲消毒和治療藥物篩選等有重要意義。本發(fā)明也為昆蟲學、醫(yī)學、畜牧獸醫(yī)學等其他原蟲研究領(lǐng)域提供很好的借鑒作用。

主要參考資料

[1] CN201310060140.3 快速檢測生物細胞死活狀態(tài)的熒光染色試劑盒及其應用

[2] CN200710099772.5 精子活力快速檢測試劑盒及其制備和使用方法

[3] CN200710026446.1 一種染色液及其染色方法和應用