背景^[1-3]

內(nèi)蒙胎牛血清是采自5-8個(gè)月胎齡牛胚胎中的胎血。此時(shí)胎牛各臟器正處生長(zhǎng)分化階段，血中含有豐富的生長(zhǎng)發(fā)育因子，非常適合各種細(xì)胞的培養(yǎng)，一旦胚胎發(fā)育完全這些因子自動(dòng)消失。因此8個(gè)月胎齡以上的牛胚胎，已接近足月，不能作為胎牛血清的原料來(lái)使用。

內(nèi)蒙胎牛血清是由胎牛血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等，其組成成份大部分已知，但還有一部分尚不清楚，這些物質(zhì)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或抑制生長(zhǎng)活性是達(dá)到生理平衡的。其中不含細(xì)胞、纖維蛋白和凝血因子。

內(nèi)蒙胎牛血清

胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)方面通常優(yōu)于其他類(lèi)型的血清。由于胎牛從未接觸過(guò)外界，與新生牛和小牛血清相比，抗體含量明顯降低，故抗體與培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)也較低，是理想的細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑。

胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用：

1.提供對(duì)維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒(méi)有或量很少的營(yíng)養(yǎng)物，以及主要的低分子營(yíng)養(yǎng)物。

2.提供結(jié)合蛋白，能識(shí)別維生素、脂類(lèi)、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)節(jié)它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。

3.有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用。

4.是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來(lái)源。

5.起酸堿度緩沖液作用。

6.提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害。

7.參與細(xì)胞凍存。

在細(xì)胞培養(yǎng)中，胎牛血清加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基的濃度大多為5%～20%（最常見(jiàn)為10%）的。具體到不同試驗(yàn)，應(yīng)依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，或細(xì)胞類(lèi)型或基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分來(lái)確定濃度。

應(yīng)用^[4][5]

用于不同濃度胎牛血清培養(yǎng)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞的比較研究

研究不同濃度胎牛血清培養(yǎng)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的一般特性如形態(tài)、核型、增殖動(dòng)力學(xué)、表型特點(diǎn)和分化成心肌樣細(xì)胞潛能等生物學(xué)性狀,并在低血清濃度下培養(yǎng)誘導(dǎo)后的心肌樣細(xì)胞,并觀察心肌樣細(xì)胞增殖和特異性蛋白的表達(dá)情況。

方法:采用全骨髓貼壁的培養(yǎng)方法獲取大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）。在細(xì)胞傳到第2代時(shí),分為5個(gè)組,加入含有不同濃度胎牛血清（FBS）的L-DMEM培養(yǎng)基,FBS濃度分別為0%,2.5%,5%,7.5%,10%,并以濃度系數(shù)標(biāo)記各組。取第4代BMSCs,利用MTT法在（1、3、5、7、9d）檢測(cè)細(xì)胞的增殖。分別取各組傳代到第4代BMCS,加入Ang II和5-Aza（Ang II 0.1μmol/l和5-Aza 10μmol/l）誘導(dǎo)劑誘導(dǎo),24h后吸棄含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液,跟換新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。取誘導(dǎo)后各組的第1代（y P1）細(xì)胞,使用MTT法檢測(cè)類(lèi)心肌細(xì)胞在（1、3、5、7d）的生長(zhǎng)活力,細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)誘導(dǎo)后培養(yǎng)至第4周時(shí)各組中c Tn I,Cx-43兩類(lèi)心肌相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,并計(jì)算其表達(dá)率。

結(jié)果:1.在5種不同濃度FBS下的L-DMEM培養(yǎng)液均可獲得第4代BMSCs;MTT檢測(cè)細(xì)胞活力（1、3、5、7、9d）結(jié)果顯示,5組不同體積分?jǐn)?shù)的FBS培養(yǎng)液均可以促進(jìn)BMSCs的生長(zhǎng),10%組＞2.5%,5%,7.5%組＞0%組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）,2.5%,5%,7.5%組組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。

2. 各組BMSCs在AngⅡ和5-Aza（AngⅡ0.1μmol/L、5-Aza 10μmol/L）聯(lián)合作用誘導(dǎo)時(shí),能分化為類(lèi)心肌樣細(xì)胞。誘導(dǎo)后的細(xì)胞MTT檢測(cè)細(xì)胞活力顯示10%組＞7.5%＞5%,2.5%組＞0%組（p＜0.05）,而5%,2.5%組比較未見(jiàn)明顯差異（p＞0.05）。各組心肌樣細(xì)胞的蛋白的表達(dá)顯示10%組＞7.5%＞5%,2.5%組＞0%組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）,而5%,2.5%組比較未見(jiàn)明顯差異,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。

結(jié)論:胎牛血清的濃度對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增有正向作用,胎牛血清的濃度為2.5%時(shí)可以滿(mǎn)足BMSCs的分離和擴(kuò)增,且細(xì)胞活力好,要想在短期內(nèi)較快獲得較純的BMSCs,可以用提高FBS濃度的辦法。BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞,胎牛血清濃度對(duì)其活力有正向作用,這些細(xì)胞可以產(chǎn)生心肌細(xì)胞所表達(dá)的c Tn I、Cx-43兩組蛋白。

參考文獻(xiàn)

[1]The role of PKCε-dependent signaling for cardiac differentiation[J].D.Galli,G.Gobbi,C.Carrubbi,D.Marcantonio,L.Benedetti,M.G.C.De Angelis,T.Meschi,M.Vaccarezza,M.Sampaolesi,P.Mirandola,M.Vitale.Histochemistry and Cell Biology.2013(1)

[2]Embryonic Stem Cell Marker Expression Pattern in Human Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow,Adipose Tissue,Heart and Dermis[J].Una Riekstina,Inese Cakstina,Vadims Parfejevs,Martin Hoogduijn,Georgs Jankovskis,Indrikis Muiznieks,Ruta Muceniece,Janis Ancans.Stem Cell Reviews and Reports.2009(4)

[3]Characterization of human skin-derived mesenchymal stem cell proliferation rate in different growth conditions[J].Una Riekstina,Ruta Muceniece,Inese Cakstina,Indrikis Muiznieks,Janis Ancans.Cytotechnology.2008(3)

[4]Concise Review:Mesenchymal Stem/Multipotent Stromal Cells:The State of Transdifferentiation and Modes of Tissue Repair—Current Views[J].Donald G.Phinney,Darwin J.Prockop.STEM CELLS.2009(11)

[5]孫國(guó)棟.不同濃度胎牛血清培養(yǎng)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞的比較[D].山西醫(yī)科大學(xué),2015.