背景及概述[1][2]
河豚大約是500種海洋有毒性魚(yú)類(lèi)中，人畜受其毒害最為常見(jiàn)者，如刺鲀科(Procupine fish，10種)、翻車(chē)鲀科(Sunfich，1種)、鲀科(Puffers，40種)。中國(guó)沿海分布有10余種，各地俗稱(chēng)“小玉斑”、“大玉斑”、“烏狼”、“?鲅”、“臘頭”、“乘魚(yú)”、“雞泡”等。中國(guó)東漢張仲景(約公元200年)所著《金匱要略》明確指出河豚的毒性。后于《本草綱目》中對(duì)海洋毒素的研究，已取得顯著成就。河豚體內(nèi)所含的毒素。是一種多羥基全氫甲基喹唑啉的復(fù)雜化合物。元素組成大約是C10-12H15-19O8-10N3，弱堿性，無(wú)色結(jié)晶。小鼠致死劑量LD50為5×10-9-10×10-9，，對(duì)中等體重的人0.3毫克在1-2小時(shí)內(nèi)即會(huì)死亡。河豚毒素一般存在于血液、卵巢、皮膚、肝臟之內(nèi)。但雙斑圓鲀等的肌肉內(nèi)也含強(qiáng)毒，暗色東方鲀腎臟毒性最強(qiáng)。河豚毒性隨季節(jié)而異，冬春之交毒性最強(qiáng)。幼魚(yú)毒性不亞于成年魚(yú)。河豚毒素穩(wěn)定，鹽腌、日曬、一般燒煮均不能解毒，若與無(wú)毒魚(yú)混腌，無(wú)毒魚(yú)亦能被其毒素污染。河豚毒素作用于神經(jīng)中樞，會(huì)導(dǎo)致呼吸循環(huán)衰竭。河豚毒素有抗癌作用，是癌癥后期的治療藥物。100千克河豚卵巢可制取河豚毒素1-2克。其提取過(guò)程是：水提取物煮沸、過(guò)濾、層析，用10%乙酸洗脫。洗脫液用活性炭吸附，再用稀乙酸洗脫，洗脫液河豚毒素結(jié)晶沉淀。
結(jié)構(gòu)及性質(zhì)[2]
河豚毒素(TTX)的化學(xué)研究始于1909 年，1964 年以后由Woodward 測(cè)定了TTX 的結(jié)構(gòu)，1972 年Kishi 等采用化學(xué)方法成功合成了河豚毒素。河豚毒素分子主要由3 個(gè)氮原子組成，它們與氫氧原子形成特殊的結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)含有1 個(gè)碳環(huán)，1 個(gè)胍基，6 個(gè)羥基，在C—5 和C—10位有一個(gè)半醛糖內(nèi)酯連接著分開(kāi)的環(huán)。有專(zhuān)家將其稱(chēng)為“自然界最奇特的分子之一”，也是世界上最致命的毒藥之一。1 g 河豚毒素的毒性是1 g 氰化物的1 萬(wàn)倍。TTX 粗制品為棕黃色粉末，純品為無(wú)色晶體，呈針狀或菱形，無(wú)臭，無(wú)味，易吸濕潮解，不溶于無(wú)水乙醇、乙醚、苯等有機(jī)溶劑，微溶于水，極易溶于稀酸水溶液。TTX 在溶液中存在TTX、半縮醛型TTX、內(nèi)酯型TTX動(dòng)態(tài)平衡的三種結(jié)構(gòu)。TTX 理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，在中性和酸性條件下對(duì)熱穩(wěn)定，240 ℃開(kāi)始碳化，但300 ℃以上也不分解。在堿水溶液中易分解，在5%氫氧化鉀溶液中于80 ℃～100 ℃可分解成黃色結(jié)晶2- 氨基- 6- 羥甲基- 8-羥基-喹唑啉，這也是TTX 化學(xué)檢測(cè)法的理論基礎(chǔ)。
作用機(jī)制[2]
1982 年，美國(guó)植物學(xué)家韋德- 戴維斯發(fā)現(xiàn)，海地巫毒教中的回魂大師在藥物中使用含有從河豚提取的毒素粉末，整個(gè)過(guò)程里中毒者大腦能完全保持清醒，如果能挺過(guò)24 h，他們就會(huì)很快恢復(fù)正常，且不會(huì)出現(xiàn)并發(fā)癥。使人們相信他們有使人“死而后生”的能力，即所謂的“還魂術(shù)”。其實(shí)，這是由于河豚毒素的特殊結(jié)構(gòu)使其像塞子一樣，凝固在神經(jīng)軸突的鈉離子通道的入口處，阻礙鈉離子透過(guò)細(xì)胞膜傳導(dǎo)神經(jīng)的沖動(dòng)，從而關(guān)閉神經(jīng)系統(tǒng)。由于河豚毒素不能越過(guò)大腦中血液細(xì)胞的屏障，因此受害者就會(huì)處于大腦清醒的無(wú)助狀態(tài)之中。幾小時(shí)或幾天過(guò)后，當(dāng)河豚毒素最終開(kāi)放鈉離子通道時(shí)大多數(shù)受害者已經(jīng)死亡。TTX 是典型的鈉離子通道阻斷劑，它能選擇性與肌肉、神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜表的鈉離子通道受體結(jié)合，阻斷電壓依賴(lài)性鈉離子通道，從而阻滯動(dòng)物電位，抑制神經(jīng)肌肉間興奮的傳導(dǎo)，導(dǎo)致與之相關(guān)的生理機(jī)能的障礙，主要造成肌肉和神經(jīng)的麻痹。構(gòu)效關(guān)系表明，TTX 的活性基團(tuán)是1，2，3 位的胍氨基和附近的C—4，C—9，C—10 位的羥基，胍基在生理pH 值下發(fā)生質(zhì)子化，形成正電活性區(qū)域與鈉離子通道受體蛋白的負(fù)電性羰基相互作用，從而阻礙離子進(jìn)入通道。
河豚毒素能夠麻痹人的肌肉和神經(jīng)，而對(duì)河豚魚(yú)自身沒(méi)有影響。日本專(zhuān)家認(rèn)為，這是因?yàn)楹与嗉∪饧?xì)胞的結(jié)構(gòu)和人的不同，研究人員對(duì)河豚肌肉表面收容體的遺傳基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中氨基酸的種類(lèi)和人類(lèi)的不同，河豚的這些氨基酸不與河豚毒素結(jié)合。除此以外，研究人員還發(fā)現(xiàn)河豚血液中有可以中和河豚毒素的蛋白質(zhì)。
應(yīng)用[2]
河豚毒素有著特殊結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理，引起了人們的廣泛關(guān)注。神經(jīng)生物學(xué)家證實(shí)微量毒液就有治療作用。河豚毒素也可作為局部麻醉藥，其局部麻醉作用比一般麻藥強(qiáng)。國(guó)外已有將河豚毒素與普通麻藥配伍作為局部麻藥的專(zhuān)利出售。河豚毒素對(duì)癌痛的鎮(zhèn)痛也很有效。研究人員發(fā)現(xiàn)癌癥病人24 h 持續(xù)杜冷丁治療收效甚微，而注射河豚毒素，每天2 次，連續(xù)3 天疼痛便緩解。河豚毒素不僅可以有效緩解晚期癌癥引起的劇烈痛楚，還可治療頑固性哮喘等。我國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)，河豚毒素還是一種戒毒良藥。研究人員對(duì)吸毒者進(jìn)行試驗(yàn)，在注射極微量的河豚毒素后，所有各種“戒毒綜合癥”在30 min 后全部消失。連續(xù)注射5 d 后可完全戒除毒癮，且沒(méi)有副作用。1998年，加拿大國(guó)際韋克斯技術(shù)公司利用河豚毒素成功研制成一種名為tetrodin 的戒毒新藥。利用河豚毒素來(lái)戒除毒癮，可謂“以毒攻毒”的一大創(chuàng)舉。目前河豚在我國(guó)的養(yǎng)殖產(chǎn)量每年達(dá)到1 至1.5 萬(wàn)t，年產(chǎn)值10 至20 億元，加工后的附加值提高5 至10 倍。但人們養(yǎng)殖河豚魚(yú)僅僅限于食用，追求無(wú)毒，實(shí)際上河豚毒素的市場(chǎng)需求量更大，而且河豚毒素本身的特點(diǎn)使其價(jià)值極為昂貴。據(jù)報(bào)道每克純度達(dá)99 %以上的河豚毒素價(jià)值高達(dá)20 萬(wàn)美元，甚至還有上升的趨勢(shì)。一旦國(guó)家開(kāi)禁，河豚未來(lái)在中國(guó)的市場(chǎng)將成為全球的市場(chǎng)，河豚毒素的應(yīng)用前景也將更為廣闊。
解毒[2]
河豚毒素的解毒現(xiàn)在還沒(méi)有找到特異性的藥物。但對(duì)于TTX 中毒者可用新鮮余甘果汁解毒。研究者將肝毒稀釋5 倍注射小鼠，然后同時(shí)注射2 mL 新鮮余甘果汁，小鼠未死亡； 對(duì)照組小鼠在125 s 左右死亡。實(shí)驗(yàn)證明余甘果汁有解毒功效，可能是新鮮余甘果汁中的超氧化物岐化酶(SOD)起解毒功效。也可注射S- P 劑(即亞硫酸氫鈉和磷酸的混合液)，據(jù)研究表明河豚毒素分子中的內(nèi)酯環(huán)是毒性的成因，內(nèi)酯環(huán)斷裂則毒性消失，S- P 試劑對(duì)內(nèi)酯環(huán)有破壞作用。試驗(yàn)中向河豚魚(yú)毒液中加入適量的S- P 試劑注射后的小鼠未死亡。用小鼠死亡時(shí)間評(píng)價(jià)碳酸氫鈉等5 種化合物拮抗河豚毒素效果，結(jié)果表明碳酸氫鈉和氫溴酸東莨菪堿對(duì)河豚毒素有明顯的拮抗作用，可使小鼠100 %或80 %存活(P<0.01)。最近有多個(gè)研究表明，4- 氨基吡啶對(duì)TTX 中毒有拮抗作用。
4- 氨基吡啶的毒副作用和安全劑量范圍小，能否用于臨床救治還需要進(jìn)一步證實(shí)。利用TTX 單克隆抗體對(duì)TTX 中毒亦具有較好的保護(hù)作用。將TTX( 5MU/mL) 與單抗在體外等體積混合，并于37 ℃孵育60 min 后再給小鼠腹腔注射，結(jié)果表明注射含0.125 mg 單克隆抗體的小鼠存活率為40 %，注射含0.25 mg 單克隆抗體的小鼠存活率達(dá)100 %。用TTX 單克隆抗體對(duì)小鼠TTX 中毒的保護(hù)作用作了進(jìn)一步研究，證實(shí)這種保護(hù)作用在TTX 與抗體分別注射的情況下也存在。75 mg/kg單克隆抗體對(duì)小鼠TTX 中毒的保護(hù)率達(dá)50%。小鼠腹腔注射1.5MU TTX，3 min 后再注射克隆抗體，通過(guò)靜脈，皮下，肌肉注射中和小鼠體內(nèi)TTX 的單克隆抗體的半數(shù)有效劑量( ED50) 分別為2.3、5.1、9.7 mg/kg。100 μg 單抗尾部靜脈注射保護(hù)率為100 %。這種與TTX 中毒相似條件下得到的研究結(jié)果充分說(shuō)明了TTX單克隆抗體對(duì)小鼠TTX 中毒的保護(hù)作用，同時(shí)也預(yù)示著TTX 單克隆抗體有望成為T(mén)TX 中毒的解救劑。但由于TTX 是小分子物質(zhì)，其抗體制備相對(duì)困難，臨床應(yīng)用受到了限制。TTX 的多克隆抗體同樣對(duì)TTX 中毒有保護(hù)作用。用TTX- TTH 免疫小鼠的腹水抗體檢測(cè)其中和河豚毒素的效用。證實(shí)了抗體能夠在體內(nèi)外有效中和河豚毒素的毒性。此抗體有望成為人類(lèi)河豚毒素中毒的被動(dòng)免疫保護(hù)途徑。
檢測(cè)[3]
除上面比較常規(guī)的方法外，國(guó)內(nèi)報(bào)道的還有分光光度計(jì)法、薄層層析法、高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳法等方法。國(guó)外報(bào)道的還有柱轉(zhuǎn)換液相色譜/質(zhì)譜/電噴霧法、薄層層析/快原子轟擊質(zhì)譜法、親水作用色譜-電噴霧質(zhì)譜法、電噴霧離子化質(zhì)譜法等方法，這些方法簡(jiǎn)單精確但是所需儀器設(shè)備都比較昂貴，不便于普遍推廣。目前河豚毒素的檢測(cè)方法多種多樣，各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)需要選擇合適的檢測(cè)方法。
制備 [2]
TTX 的提取方法主要有乙酸提取或改良乙酸提取、樹(shù)脂提取和甲醇提取等。目前，我國(guó)TTX 提取常用的方法是從河豚魚(yú)體不同部位提取純化TTX，一般工藝流程為： 河豚魚(yú)→水，乙酸等浸提→除蛋白質(zhì)、脂類(lèi)→離子交換等方法分離→脫色→活性炭吸附、聚丙烯酰胺層析等方法純化→濃縮、精制→結(jié)晶，此法TTX的提純難達(dá)到試劑級(jí)的高精水平。由于很多文獻(xiàn)報(bào)道TTX 多克隆抗體能夠與TTX 特異性結(jié)合，中和其毒性，因此可以考慮將TTX 多克隆抗體偶聯(lián)于載體制成免疫親和層析介質(zhì)，再對(duì)TTX 進(jìn)行純化，簡(jiǎn)化其提取工藝，提高TTX 產(chǎn)率。由于大量捕殺河豚魚(yú)受到資源和時(shí)空的限制，破壞了河豚魚(yú)資源，甚至導(dǎo)致生態(tài)平衡的破壞，所以人們不得不另辟蹊徑。根據(jù)河豚毒素的微生物起源，分離出產(chǎn)河豚毒素的微生物類(lèi)群，通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)產(chǎn)生河豚毒素。
產(chǎn)TTX 的微生物類(lèi)群有弧菌屬(Vibrio)的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鰻弧菌(Vibrioanguillarum)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，希瓦氏菌屬的腐敗希瓦菌(Shewanella putrefy aciens)，交替單胞菌(Alteromonas)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，鏈霉菌屬(Streptomyces)，其中產(chǎn)毒力較高的主要是溶藻弧菌和河豚毒素互生單胞菌(Alteromonas tetrodonis)[8]。但微生物產(chǎn)河豚毒素產(chǎn)量非常低，僅為ng 級(jí)。由于其產(chǎn)生機(jī)制尚不清楚，提高其產(chǎn)量及其純化方法也是一個(gè)難題。
主要參考資料
[1] 海洋大辭典
[2] 河豚毒素的研究進(jìn)展
[3] 河豚毒素的理論及應(yīng)用研究進(jìn)展