背景[1-3]
5-甲酰環(huán)連接酶抗體是一類可以特異性結(jié)合5-甲酰環(huán)連接酶的多克隆抗體，主要用于體外檢測(cè)5-甲酰環(huán)連接酶的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。
葉酸作為介導(dǎo)一碳代謝的重要輔因子,參與生物體內(nèi)的多種代謝活動(dòng)。5-甲酰四氫葉酸環(huán)化連接酶(5FCL)被報(bào)道催化貯存形式的5-甲酰四氫葉酸(5-CHO-THF)向代謝活性形式的葉酸轉(zhuǎn)化。
5-甲酰環(huán)連接酶
葉酸及其類似物甲酰四氫葉酸，常以多聚谷氨酸結(jié)合物（主要有碟酰三谷氨酸及碟酰七谷氨酸）的狀態(tài)廣泛分布于生物中，在正常情況下，它們皆可被小腸上皮細(xì)胞分泌的γ-L谷氨酸-羥基肽酶水解成谷氨酸和自由葉酸，自由型葉酸在小腸上部易于吸收，在體內(nèi)的腸壁、肝、骨髓等組織中，在維生素C和還原型輔酶Ⅱ（NADPH）的參與下，葉酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩砘钚缘?,6,7,8-四氫葉酸，其反應(yīng)由葉酸還原酶來(lái)促進(jìn)。
抗體是可溶性Y形球蛋白，響應(yīng)于抗原的存在，由免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞合成和分泌。具有可變區(qū)和高可變區(qū)的抗原結(jié)合位點(diǎn)（Fab）通常不考慮綴合，因?yàn)檫@會(huì)干擾表位的結(jié)合。而且，在鉸鏈區(qū)的破壞使分子具有結(jié)合的靈活性，可能破壞抗原相互作用。因此，在制備抗體-綴合物時(shí)，必須盡可能保持Fab和鉸鏈區(qū)不受干擾。
迄今為止，鑒定出的所有五類抗體-IgG，IgM，IgA，IgD和IgE已用于研究，診斷和治療。
應(yīng)用[4][5]
用于結(jié)核分枝桿菌葉酸代謝相關(guān)基因Rv0992c的性質(zhì)及功能研究
通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)M.tuberculosis H37Rv的未知功能基因Rv0992c的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析及預(yù)測(cè),并對(duì)該基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及蛋白產(chǎn)物酶學(xué)活性研究。從之前對(duì)深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）的研究得知RruA1084基因編碼5-甲?；?四氫葉酸環(huán)連接酶（5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase,也稱為次甲基-四氫葉酸合成酶,MTHFS）。
M.tuberculosis中Rv0992c基因是Rru A1084的同源物（二者的氨基酸序列具有32.7%的相似性和21.8%的同源性）,所以推測(cè)前者編碼結(jié)核分枝桿菌的5-甲酰基-四氫葉酸環(huán)連接酶。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得M.tuberculosis H37Rv的Rv0992c的核苷酸序列,設(shè)計(jì)對(duì)引物,以M.tuberculosis H37Rv全基因組為模板,PCR擴(kuò)增獲得Rv0992c基因。通過(guò)TA克隆,將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector上,之后亞克隆至載體pET28上,經(jīng)菌落PCR,質(zhì)粒酶切以及核苷酸序列測(cè)序證明了成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28-Rv0992c。
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21（DE3）,以溫度、時(shí)間和IPTG濃度建立三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化該重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)條件。以表達(dá)條件（0.8mM的IPTG,25℃下誘導(dǎo)4h）進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),Ni+凝膠親和層析柱純化獲得高純度的重組Rv0992c蛋白。純化蛋白的酶學(xué)活性通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)物5,10-次甲基-四氫葉酸在355nm處吸光度的變化得到證實(shí)。運(yùn)用Vector NTI 9,Swiss Model等生物信息學(xué)資源對(duì)結(jié)核分枝桿菌Rv0992c編碼蛋白的基本性質(zhì)進(jìn)行了分析,包括對(duì)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的預(yù)測(cè),二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析。
結(jié)果表明：M.tuberculosis H37Rv Rv0992c基因編碼蛋白分子量為21412.95Da,理論P(yáng)I為9.40；二級(jí)結(jié)構(gòu)是由3個(gè)α螺旋8個(gè)β折疊及無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成的。在一二級(jí)結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上,利用同源建模的方法完成了其三維結(jié)構(gòu)的建模。分析該蛋白在分枝桿菌屬中的分布情況,結(jié)果顯示M.tuberculosis H37Rv的MTHFS同已報(bào)道的其他分枝桿菌屬來(lái)源的MTHFS有較高的同源性。
綜上,本研究揭示了M.tuberculosis H37Rv Rv0992c序列編碼蛋白具有將5-甲酰-四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5,10-次甲基-四氫葉酸的生物學(xué)功能。
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