背景^[1]

煙草蝕紋病毒蛋白酶（Tobacco Etch Virus protease，TEVp）是一種高特異性、高保守的重要工程蛋白，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性尤為重要；鈷離子（Co2+）具有一定的生物毒性. 為了解Co2+對(duì)TEVp結(jié)構(gòu)的影響，運(yùn)用內(nèi)源熒光方法和同步熒光方法探討Co2+對(duì)TEVp結(jié)構(gòu)的調(diào)控機(jī)理. 光譜顯示Co2+對(duì)Recombinant Tobacco EV內(nèi)源熒光有明顯的淬滅作用，導(dǎo)致TEVp分子中色氨酸酪氨酸殘基的疏水性增加. 在300 K和311 K溫度條件下，淬滅常數(shù)Ksv分別為4.161 × 102 L/mol和2.129 × 102 L/mol，結(jié)合平衡常數(shù)KA分別為6.625 × 103 L/mol和5.132 × 103 L/mol，且動(dòng)態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于擴(kuò)散碰撞淬滅速率常數(shù)的值2.0 × 1010 L mol-1 s-1，表明其淬滅機(jī)制屬于靜態(tài)淬滅. 吉布斯自由能ΔG < 0，焓值ΔH < 0且熵值ΔS > 0，表明Co2+與Recombinant Tobacco EV的相互作用能夠自發(fā)進(jìn)行，且它們之間的主要作用力類(lèi)型為靜電作用力.

Co2+對(duì)Recombinant Tobacco EV內(nèi)源熒光的淬滅作用^[2]

以往的光譜學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的熒光性質(zhì)與其氨基酸殘基所處微環(huán)境的疏水性密切相關(guān). Co2+對(duì)Recombinant Tobacco EV內(nèi)源熒光發(fā)射光譜的影響見(jiàn)圖1.  由圖1A可知，pH為7.4、激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm時(shí)，Recombinant Tobacco EV的內(nèi)源熒光發(fā)射峰約位于342.2 nm，表明熒光發(fā)色氨基酸如酪氨酸、色氨酸等殘基位于TEVp分子內(nèi)部疏水區(qū). 隨著Co2+的加入，光譜的熒光強(qiáng)度逐漸降低，Co2+對(duì)TEVp內(nèi)源熒光有明顯的淬滅作用.并且隨著Co2+濃度增加，發(fā)射波長(zhǎng)逐漸藍(lán)移至約340 nm，表明熒光發(fā)色氨基酸如酪氨酸、色氨酸等殘基周?chē)h(huán)境的疏水性增加，其周?chē)Y(jié)構(gòu)更加緊密.

Co2+對(duì)Recombinant Tobacco EV熒光的淬滅方式^[3]

因熒光淬滅機(jī)制不同，熒光淬滅過(guò)程通常有靜態(tài)淬滅和動(dòng)態(tài)淬滅兩種方式，熒光激發(fā)態(tài)分子與淬滅劑之間的相互作用過(guò)程為動(dòng)態(tài)淬滅. 此種淬滅的表征手段主要是溫度越高，淬滅常數(shù)就隨之增大. 由于淬滅劑與熒光體分子在基態(tài)形成不發(fā)光的配合物或分子間復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光體發(fā)光強(qiáng)度降低的過(guò)程為靜態(tài)淬滅.因?yàn)樵陟o態(tài)淬滅過(guò)程中產(chǎn)生了不發(fā)熒光的配合物，溫度升高，配合物穩(wěn)定性降低，其淬滅常數(shù)隨之降低. 根據(jù)Stern-Volmer方程（公式1），計(jì)算了Recombinant Tobacco EV的熒光強(qiáng)度比值F0/F隨Co2+濃度的變化，根據(jù)方程求得Stern-Volmer淬滅常數(shù)Ksv與動(dòng)態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)Kq，  Ksv隨溫度的升高而降低，且Kq遠(yuǎn)大于擴(kuò)散碰撞淬滅速率常數(shù)的值2.0 × 1010 L mol-1 s-1. 因此，Co2+對(duì)Recombinant Tobacco EV的熒光淬滅方式應(yīng)為靜態(tài)淬滅. 此結(jié)果類(lèi)似于邢本剛等關(guān)于Co2+對(duì)蛋白質(zhì)淬滅方式的判定。

參考文獻(xiàn)

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