苦茶堿（1,3,7,9-四甲基尿酸）是一種天然產物，具有顯著的抗抑郁、鎮(zhèn)靜、催眠等藥理活性，而咖啡因（1,3,7-三甲基黃嘌呤）對特殊人群有一定的副作用。因此，培育具有高苦茶堿和低咖啡因的茶樹將增加茶的健康益處并促進消費。在本研究中，作者通過“中茶302”（無苦茶堿）和茶葉種質“乳源苦茶”（RY，富含苦茶堿）雜交構建F1群體，以確定苦茶堿積累的因果基因。結果表明，苦茶堿的含量與咖啡因呈高度負相關（R2 > 0.9）。BSR-seq測序分析、分子標記和基因表達分析表明苦茶堿合酶(TcS)基因是候選基因。TcS位于細胞核和細胞質中，通過喂食底物1,3,7-三甲基尿酸可以在穩(wěn)定遺傳轉化的煙草中檢測到苦茶堿。此外，體外酶活性實驗表明，第241個氨基酸殘基是關鍵殘基。此外，作者在不同苦茶堿水平的幾個茶種質中擴增了啟動子區(qū)域，并在 RY 中發(fā)現(xiàn)了 234 bp 的缺失和 271 bp 的插入。GUS 組織化學分析和雙熒光素酶測定均表明 RY 中的 TcS 啟動子活性相對較高。最后，作者開發(fā)了一種分子標記，它與 RY 后代中的高苦茶堿個體共同分離。這些結果表明，RY中新的TcS等位基因導致高苦茶堿和低咖啡因性狀，開發(fā)的功能標記將促進特色茶樹的育種。