背景及概述[1][2]
茜素絡(luò)合指示劑(Alizarin complexone )為姜黃色粉末，微溶于水、乙醇和乙醚， 在 pH>5 時能溶于水，pH< 5 時為黃色，pH≥6 時為紅色，pH>11.5 時為藍(lán)色。其化學(xué)全稱是3-茜素甲基胺-N，N-二乙酸，又名茜素氨羧絡(luò)合劑，也叫氟試劑。它主要用作螯合滴定鋇、鈣、鎘、鈷、銅、銦、鉛、鍶、鋅等金屬的絡(luò)合指示劑，是測定氟的高靈敏度和特效性光度試劑。
制備[1]
茜素絡(luò)合指示劑的合成工藝路線一般是由茜素、甲醛和亞氨基二乙酸在堿性條件下，進(jìn)行曼尼期(Mannich) 縮合反應(yīng)，再利用茜素絡(luò)合指示劑在酸堿性 ( pH大于或小于5) 條件下，水中溶解度的差異而進(jìn)行分離、精制。
1. 茜素絡(luò)合指示劑的合成
1.1 原料亞氨基二乙酸鈉的制備
在 1000 mL 燒杯中，加入 100 g 亞氨基二乙酸，攪拌下，慢慢加入62.4 g氫氧化鈉和140 mL純水配制成的溶液，攪拌均勻，靜置冷卻，自然結(jié)晶，離心得白色結(jié)晶。
1. 2 縮合反應(yīng)
一個裝有攪拌機(jī)、溫度計 (100℃)、冷凝管、氮氣導(dǎo)入管的 1 000 mL 四口燒瓶中，加入乙醇 400g、N，N- 二甲基甲酰胺40g、亞氨基二乙酸鈉 (上述)32.5 g、茜素 10 g 及 2 mol/L氫氧化鈉溶液 77.5 mL，攪拌下，加熱使溫度升到70℃左右，加入份25g(甲醛6.5 g+乙醇18.5g) 混合液，保持溫度 77~79℃，反應(yīng) 3 h 后，加入第二份甲醛、乙醇混合液(配比同前) 18g，繼續(xù)回流3 h，再加入第三份 18g甲醛、乙醇混合液，共回流 12 h后，放置，冷卻。次日，將析出的沉淀物濾出，得到紫紅色固體，再將其加入3倍的純水中，加熱至 50 ℃溶解后，加10%鹽酸至pH=1.8，析出橙黃色(帶褐色)固體，即為粗品茜素絡(luò)合指示劑。
1.3 精制
在粗品茜素絡(luò)合指示劑中，加入4倍量的純水，攪拌下，加入1 mol/L 氫氧化鈉溶液，調(diào)至 pH=5.5，加熱至50℃左右，10mim 后過濾，濾液用活性炭處理到游離茜素含量合格為止。然后，在濾液中加入10%鹽酸，酸化至 pH=1.8， 析出橙黃色沉淀，濾出沉淀，用澄清的 pH=1.8 的鹽酸洗滌，在45℃干燥得成品 10.5 g， 得率 66.5 %。熔點180 ℃(分解) 1HNMR(DMSO)， δ:3.40(s，4H); 3.97 (s，2H); 7.60 (s，1H); 7.80 ~7.95(m，2H); 8.10~8.25(m，2H); 12.53(br，4H)。
應(yīng)用 [2-3]
一、用于標(biāo)記刺參個體
刺參體壁柔軟，缺乏鈣質(zhì)骨骼，對異物有排異反應(yīng)，故難以使用傳統(tǒng)標(biāo)記方法對其進(jìn)行標(biāo)記。國內(nèi)尚未見標(biāo)記海參的相關(guān)方法。CN201010105394.9提供一種容易操作、便于識別、標(biāo)記保持時間長，而且避免排異反應(yīng)的標(biāo)記刺參個體及檢測該標(biāo)記的方法。包括以下步驟：
(1)取一定數(shù)量的健康刺參暫養(yǎng)在流水水槽中，禁食24-48小時，連續(xù)向水槽中充氣(空氣)；
(2)配制濃度為40-160mg/L的茜素絡(luò)合指示劑(英文名：Alizarin Complexone dihydrate，分子式：C19H15NO8)的染料溶液；
(3)將刺參放入所述茜素絡(luò)合指示劑的染料溶液中浸泡16-48小時，期間連續(xù)充氣(空氣)，停止喂食
檢測采用上述標(biāo)記方法標(biāo)記的刺參的方法，包括以下步驟：
(1)刮取小米粒大小刺參的體壁表皮或結(jié)締組織，鋪在載玻片上；
(2)向刺參體壁表皮或結(jié)締組織上滴加1-2滴10wt％NaClO水溶液，待體壁表皮或結(jié)締組織溶解后，滴加蒸餾水1-2滴進(jìn)行稀釋，加蓋玻片；
(3)在熒光顯微鏡熒光激發(fā)波長510-560nm下，觀察用上述方法制成的載玻片。
本發(fā)明的有益效果是：
1、本發(fā)明的標(biāo)記方法完全是在刺參正常生長狀態(tài)下進(jìn)行，無需對刺參進(jìn)行注射或麻醉，不損傷刺參活體，減少了標(biāo)記的操作步驟，避免刺參活力降低，降低死亡率。2、本發(fā)明所使用的染料價格低廉易得，節(jié)省了標(biāo)記所需費用。3、此外，采用本發(fā)明的標(biāo)記方法，由于染料僅對刺參體壁內(nèi)骨片染色標(biāo)記，并未植入外來異物，避免刺參對異物的排異反應(yīng)，從而延長了標(biāo)記的保留時間。
二、用于標(biāo)志石首科幼魚
CN201410145230.7提供一種標(biāo)志石首科幼魚的方法，該方法操作簡單、標(biāo)志 效果好、成本低、容易識別，而且對于魚類幼魚無毒、無損傷。石首科魚類有大黃魚、黃姑魚、日本黃姑魚、雙棘黃姑魚、淺色黃姑魚、美國紅魚等，養(yǎng)殖區(qū)域主要集中在東海沿岸。石首科魚類的耳石比較大，熒光 物質(zhì)會在耳石上形成永久的標(biāo)記，可以用于魚類標(biāo)記流放。其步驟包括：（1）熒光染色母液的配置：將茜素絡(luò)合指示劑粉末溶于水，制成濃度為 0.5-1g/L的熒光染色母液，用KOH或者NaOH溶液作為pH調(diào)節(jié)劑，將熒光染色 母液的pH值調(diào)節(jié)至8-9；（2）標(biāo)志：將步驟（1）中的熒光染色母液稀釋至濃度為90-110ppm的熒 光染色液，將石首科幼魚浸泡在該熒光染色液中22-24小時，浸泡的同時，向染色液中通入純氧。本發(fā)明的有益效果是：1、本標(biāo)志石首科幼魚的方法操作簡單，幼魚的耳石染色后為粉紅色標(biāo)志色，容易識別，無毒無損傷，標(biāo)志色保持率高，保留時間長。2、本標(biāo)志石首科幼魚的方法可進(jìn)行大批量標(biāo)志處理，節(jié)約了標(biāo)志時間，而且使用過的熒光染色劑可以重復(fù)多次利用，降低了標(biāo)志成本。3、若采用本標(biāo)志方法染色效果不明顯，可進(jìn)行二次染色，石首科幼體無應(yīng)激反應(yīng)。
主要參考資料
[1]柯德宏.茜素絡(luò)合指示劑合成工藝的探索[J].上?；?，2007(12):15-17.
[2] CN201010105394.9 一種標(biāo)記刺參個體及檢測該標(biāo)記的方法
[3] CN201410145230.7 一種標(biāo)志石首科幼魚的方法