背景及概述^[1][2]

人類的生長激素(Growth hormone，GH)是一條單鏈、非糖化、191 個氨基酸組成的親水性球蛋白，分子量21700Da，等電點pI 為4.9 。在53 位與165 位和182 位與189 位半胱氨酸殘基間由二硫鍵相連；大約75 %垂體腺前葉嗜酸細胞分泌的生長激素是以此種分子結構形式分泌的，還有5 %～ 10 %是以分子量20kDa 形式分泌。hGH 構象中約有50 %α_螺旋，從三維結構看，hGH 包括四個反平行α_螺旋，其中三個α_螺旋起關鍵作用。分泌hGH 的細胞(在腺垂體的后外側部)含圓形致密的分泌顆粒，直徑約300~350nm 。hGH 屬蛋白質激素，不通過靶腺產(chǎn)生生理效應，它的受體遍及全身。用125 Ⅰ標記的hGH 實驗研究發(fā)現(xiàn)hGH 的受體在細胞膜上，肝、腎、脾、胰、腸、腎上腺皮質、心和骨骼肌的細胞表面都有較多的受體與125 Ⅰ_GH 結合。hGH 的作用機理一般認為是通過cAMP 進行的。在與靶細胞結合后，能改變氨基酸及代謝產(chǎn)物的運轉，誘導某些特異性蛋白質和核酸的合成。

結構^[3]

人生長激素有兩種基因-hGH-N 和hGH-V，分別編碼蛋白hGH-N 和hGH-V。兩者結構同源性達93 %，只有13 個殘基不同。通常講的hGH基因是指hGH-N，hGH 蛋白也是指hGH-N，它位于2.6Kb DNA 片段中，由5 個外顯子和4 個內(nèi)含子和3′及5′不翻譯區(qū)(包括500bp 啟動子區(qū)域)組成。而hGH-V 基主要在胎盤中表達，在胎兒和胎盤生長和發(fā)育中起作用。這兩個基因都先翻譯為激素原，然后通過酶水解加工成為具有生物活性的形式。

分泌

hGH 自發(fā)性分泌在晝夜間呈陣發(fā)性形式，一般發(fā)生在生理睡眠后第1 個慢波睡眠期(SWS)。白天休息時似能促進hGH 的釋放，攝食、空腹、運動和應激可影響hGH 的分泌形式，但不改變其基礎節(jié)律；青春期hGH分泌幅度高、頻率快、晝夜分泌總量大，而老年人則相反。

生理作用及應用^[3]

1.人生長激素的促生長作用

人生長激素最明顯的作用是促進骨、軟骨和組織的生長，它刺激蛋白質和膠原的合成以及組織對循環(huán)系統(tǒng)中氨基酸的攝取和利用。人在幼年與成年時hGH的水平并無多大的差異(血清或血漿中檢測的常規(guī)參考值為：成年男性<2μg/L ；成年女性<10μg/L ；兒童<20μg/L，但在人生長發(fā)育的幼年和育成期時，機體組織對hGH 更為敏感。hGH 對骨的促生長作用取決于骺軟骨在成長中的狀況。人與貓、犬、豬、牛及羊等動物一樣，在幼年和育成期時GH 對四肢長骨生長有促進作用，故出生后至性成熟期先是體高增長加快，隨后主要促進軀干脊柱的生長，此時體長的生長較為迅速，至成年時四肢和脊柱的生長已基本結束，但成年時軀干向寬度增長，雄性動物的胸寬、雌性動物的尻寬增大與性腺激素有密切關系。

hGH 對維持骨的延長雖屬必要，但并非起直接作用。它是通過血中SM 或稱硫酸化因子(Sulfation factor)來實現(xiàn)。這是一種肽類激素，分子量4000Da，能促進SO2 ^-4 、3H -胸苷、3H-尿苷和14C -亮氨酸進入軟骨，增加膠原組織和蛋白質合成，促進軟骨細胞、肝、肌肉和纖維母細胞的分裂。目前已純化出3 種SM(A 、B、C)。SM-C 在促生長中較重要，它與SM -A 結構相似，為單鏈多肽，在血漿中有特異運載蛋白和抑制物的功能。SM-C 及其運載蛋白的含量受hGH 調控。

2.hGH 促進蛋白質合成

hGH 能促進氨基酸進入細胞，加速蛋白質的合成，減少尿素、肌酸和氮的排出，促使體內(nèi)保持氮的動態(tài)平衡。在蛋白質的合成過程中，hGH 可加強tRNA 合成，促進氨基酸的攝取。嘌呤霉素不能阻斷此效應，提示hGH 不是促進細胞內(nèi)形成某種新蛋白質而是加強氨基酸的運轉。胰島素能促進氨基酸進入細胞，但要在hGH 存在時有此效應。

3.hGH 對脂肪和糖代謝的影響

hGH 能促使動物的脂肪分解，增加和抑制葡萄糖氧化，減少葡萄糖的消耗。hGH 對糖代謝作用較復雜。生理水平的hGH 可刺激胰島素β 細胞，引起胰島素分泌，加強葡萄糖的利用。過量的hGH 則抑制葡萄糖的利用。

4. hGH 對能量代謝的影響

hGH 具有穩(wěn)定糖原的作用，能使正常動物在饑餓時骨骼肌保持糖原水平不變，心肌糖原水平還有所增加，從而有利于能量的儲備，并有利于促使脂肪酸進入肝臟后在肝內(nèi)氧化以提供能量，即可以使能量的來源由糖代謝向脂肪代謝轉移，這對某些耐力運動是有利的。

制備^[4][1]

目前生產(chǎn)人生長激素主要是通過兩種方法。一種是從人的尸體中摘取腦垂體做材料，進行人工提取，但不久就被證實在人體無活性。人腦垂體中生長激素的含量只占干重的4 %～ 8 %，從人的一個垂體中最理想的情況下也只能制得3~5mg 的生長激素。另一種是用基因工程方法生產(chǎn)?；蚬こ谭椒ǖ纳a(chǎn)也可分成兩類：一類是在原核生物中生產(chǎn)，另一類是在真核細胞中生產(chǎn)。

hGH 的cDNA(或前體的cDNA)已可在細菌或哺乳動物細胞中表達，但由于hGH 沒有糖鏈，用細菌表達不會存在由于無翻譯后修飾造成影響，因此大部分研究者采用原核細胞系統(tǒng)表達。早在1979 年Goeddel 等就將hGH 的DNA 轉錄入大腸肝菌表達載體的lac 啟動子末端，在帶這個重組質粒的大腸桿菌中，得到N -端多一個Met 殘基的重組人生長激素，其生物活性和天然產(chǎn)物相同。

雖然臨床使用表明Met_rhGH 治療效果和人垂體分離的hGH 相似，但Met_rhGH 在治療過程中容易誘導較大的免疫反應，即使是高純度Met_rhGH 制劑，仍有50 %～ 80 %病人會產(chǎn)生抗體，而使用人垂體hGH 制劑在臨床上產(chǎn)生抗體的比例約為5 %～ 20 %，推測這個額外Met 與引起免疫反應有關。雖然高純度Met_rhGH治療后產(chǎn)生的抗體一般滴度較低，病人的生長速度不完全停止，但還是趨向應用N -端不帶Met 的rhGH .用大腸桿菌生產(chǎn)無Met 的rhGH 有兩種方法，一種是在胞內(nèi)表達產(chǎn)生Met_rhGH 后，在加工、純化過程中用酶法除去Met 分子；另一種方法是用分泌型載體，把hGH 成熟蛋白的編碼序列直接轉錄入高表達高分泌啟動子和信號序列后面，在分泌過程中切去信號肽，使表達的hGH 累積在細胞質中，其表達量可達細胞總蛋白的6 %~10 %，由這種載體表達的hGH 總量可達20.5mg/L，其中11.2mg/L 在胞外，8.6mg/L 在細胞周質，胞內(nèi)只占0.7mg/L 。

除大腸肝菌外，目前用于臨床的hGH 還可由芽孢桿菌系統(tǒng)表達，但以大腸桿菌系統(tǒng)表達占多數(shù)。美國的Genencor 和Genentech 公司采用枯草桿菌系統(tǒng)表達，他們詳細比較了幾種啟動子、核糖體結合位點序列、轉錄終止子和宿主菌株，以化組合表達，hGH 產(chǎn)量可高達1.5g/L 。

測定

因為生長激素在體內(nèi)代謝快，半衰期短，含量極微和排泄量少等特點，使得尋找一種理想的、能判斷是否濫用了生長激素的檢測方法十分困難。目前測定人生長激素的方法主要有放射免疫測定法(RIA)、免疫放射測定法(IRMA)、酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、時間分辨熒光免疫分析法(TRIFMA)和生物檢定法等多種，以RIA和ELISA 法應用較廣。

1）放射免疫測定法(RIA)：可測出尿、體液和組織提取物中微量GH。其測試原理為：GH 抗原與定量同位素標記抗原一起與限量專一抗體發(fā)生競爭性結合，反應平衡后，測沉淀物中cpm，根據(jù)標準曲線計算出未知樣品含量。在腺垂體中GH 的含量約為垂體干重的4 %～ 8 %，即含3~5mg，似無年齡差異。正常人血漿GH含量為1~5ng/ml，飯后3~4h 略有升高，深睡后1h GH明顯升高，且持續(xù)時間達2~3h，GH 在血漿中半衰期為20~25min 。其檢測靈敏度為200ng/L。

2）酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)：是針對hGH 不同抗原決定簇的兩株單克隆抗體，建立雙抗體夾心ELISA 法測定血清hGH。其檢測靈敏度為1ng/L。成人參考值0.5~5ng/ml。

3）時間分辨熒光免疫分析法：測定原理是用鼠抗hGH 單克隆抗體(mAb)包被固相載體，加入hGH 標準液或待測樣品(抗原)與固相載體結合，洗去無關成分后，加入銪(Eu3 +)標記的鼠抗hGH mAb，反應后洗去無關成分，加入熒光增強液，最后測熒光強度。

4）生物檢定法：脛骨試驗是經(jīng)典的試驗法，即對去垂體動物投給測試激素樣品，2~3 周后測量脛骨近端骺軟骨增加的寬度。該法可測出巨人癥、肢端肥大癥及胰島素所致低血糖時血漿中高GH 水平，但不能測出正常人血中的GH 水平。另一種方法是測定體重的增加和氮潴留的增加來確定GH 。另外，根據(jù)目前的研究，設法追蹤與生長激素相關的生長素介質，可能為檢測生長激素尋找到一個突破口。其原理為：正常人的血清中IGF_Ⅰ 和IGF_Ⅱ 的濃度遠遠高于生長激素的濃度。

如果正常人或垂體功能低下的人使用了生長激素，則會使血清中IGF_Ⅰ 增高，而且這一作用在生長激素作用消失后還將延續(xù)一段時間，因為IGF_Ⅰ的合成和代謝清除都比較緩慢。因此，可以用測定IGF_I 和IGF -Ⅱ與生長激素濃度的比值來間接地判斷人生長激素在血漿中含量的變化，從而推測是否濫用了生長激素。但該方法目前僅僅停留在理論研究階段，實際操作的方法尚未確定，且至少還有一些具體問題需要解決，比如正常人和從事高強度運動的運動員的常規(guī)值水平需要確定等等。

主要參考資料

[1] 王德芬，王偉主編.生長激素與生長激素治療[ M] .上海：上?？茖W技術文獻出版社，1998 .

[2] 陳蓓, 朱威. 人生長激素研究進展[J]. 生物學雜志, 2004, 21(1): 9-11.