背景[1-3]
ECV-304細(xì)胞專用培養(yǎng)基保持ECV-304細(xì)胞的生長狀態(tài)。本產(chǎn)品中已包含ECV-304細(xì)胞生長所需的各種成分，無需添加任何成分，可直接用于ECV-304細(xì)胞的體外培養(yǎng)。
ECV-304細(xì)胞專用培養(yǎng)基
細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備M199培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，15%；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二．細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細(xì)胞的培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.收到細(xì)胞后首次傳代推薦將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2到1:5的比例進(jìn)行。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
應(yīng)用[4][5]
用于二氫睪酮對過氧化氫誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究
究二氫睪酮（dihydrotestosterone,DHT）對過氧化氫誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及可能機(jī)制,分析雄激素對血管內(nèi)皮細(xì)胞及動脈粥樣硬化的作用。
方法：采用合適濃度過氧化氫（H2O2 100μM）誘導(dǎo)損傷ECV-304細(xì)胞,造成細(xì)胞凋亡模型;利用不同濃度二氫睪酮（0.01,0.1,1μM）預(yù)處理細(xì)胞;根據(jù)不同處理方法將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為6組:正常對照組,單純H2O2損傷組,低濃度DHT處理組（0.01μM）,中濃度DHT處理組（0.1μM）,高濃度DHT處理組（1μM）,高濃度DHT對照組（1μM）。通過光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、MTT法檢測細(xì)胞活性和流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞比例,觀察二氫睪酮對過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用;通過WesternBlot法檢測Caspase-3、Caspase-9和phospho-p38 MAPK表達(dá),觀察此種保護(hù)作用的可能機(jī)制。
結(jié)果：1光鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察①在正常對照組和高濃度DHT對照組（1μM）可見極少量凋亡細(xì)胞。②單純H2O2損傷組,大部分細(xì)胞顯示出凋亡的征象,比如染色質(zhì)分離、染色體濃縮、胞體皺縮等。③在另外三組不同濃度DHT處理組中,凋亡細(xì)胞比例隨著DHT濃度升高而逐漸降低。提示DHT具有拮抗H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用,并且這一作用呈現(xiàn)劑量依賴性。
2 MTT法觀察細(xì)胞活性與正常對照組和高濃度DHT對照組比較,單純H2O2損傷組OD值顯著下降;不同濃度DHT處理組,OD值隨著DHT濃度升高而逐漸升高,高濃度DHT處理組OD值與正常對照組和高濃度DHT對照組比較無顯著差異。提示實(shí)驗(yàn)所用濃度DHT無明顯細(xì)胞毒作用,并且具有保護(hù)細(xì)胞活性作用,作用強(qiáng)弱與濃度呈正相關(guān)。
3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡與正常對照組比較,單純H2O2損傷組凋亡細(xì)胞比例顯著增加（49.96%vs2.95%）。不同濃度DHT處理組（0.01,0.1和1μM）凋亡細(xì)胞比例明顯降低,并且呈劑量依賴性（33.54%、20.04%和6.76%）。正常對照組和高濃度DHT對照組凋亡細(xì)胞比例沒有顯著差異（2.95%vs 3.92%）。提示DHT顯著降低H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,這種保護(hù)作用呈現(xiàn)一種劑量依賴性。
4 Western Blot法檢測信號分子表達(dá)DHT可以抑制H2O2誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞內(nèi)Caspase-3,Caspase-9和phospho-p38 MAPK的蛋白表達(dá),其中高濃度DHT處理組條帶亮度最低,與正常對照組和高濃度DHT對照組接近。提示DHT抑制細(xì)胞凋亡的作用可能通過Caspase-3,Caspase-9和phospho-p38 MAPK等信號分子實(shí)現(xiàn)。
參考文獻(xiàn)
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[4]Gonadal and adrenal androgen deficiencies as independent predictors of increased cardiovascular mortality in men with type II diabetes mellitus and stable coronary artery disease[J].Beata Ponikowska,Ewa A.Jankowska,Jolanta Maj,Kinga Wegrzynowska-Teodorczyk,Bartosz Biel,Krzysztof Reczuch,Ludmila Borodulin-Nadzieja,Waldemar Banasiak,Piotr Ponikowski.International Journal of Cardiology.2009(3)
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