背景[1-3]
小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)完全培養(yǎng)基(無說明書)用于小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)。
實驗方法原理：將小鼠的成纖維細胞（MEF）從機體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置MEF生長培養(yǎng)基培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖。
小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)
小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）原代培養(yǎng)步驟:
1.用無菌眼科小剪刀或刮胡刀片將鼠胚軀干剪(切)成1mm3以下的碎塊，吸置于離心管內(nèi)。
2.加適量胰酶，將離心管置于培養(yǎng)箱中10-20分鐘
3.取出離心管，反復(fù)吹打，加足量培養(yǎng)液終止消化。
4.離心1000轉(zhuǎn)，5分鐘。
5.棄掉上清，加適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹打20次。
6.分裝到T75中，一般每2個胚胎可以制成一個T75的原代細胞。
7.置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
8.待細胞長3-7天細胞互相重疊爬滿整個培養(yǎng)瓶底時即可1：3-1：6傳代。
9.吸棄培養(yǎng)液上清。
10.PBS（不含鈣鎂）沖洗兩次。
11.加0.25%胰酶-0.02EDT消化。
12.在顯微鏡下觀察，當少量細胞漂浮，貼壁的細胞層出現(xiàn)裂隙時，用移液管吹打沖洗瓶底5-6次。
13.即刻加MEF培養(yǎng)液終止消化。
14.1000轉(zhuǎn)，5分鐘離心。吸棄上清。
15.加足培養(yǎng)液，吹打制成單細胞懸液，分裝到各T75中。完成傳代。
16.原代細胞中還有少量組織塊未被充分消化，在以后的每次傳代過程中要盡量制成單細胞懸液，組織塊會逐漸消失。
17.原代細胞中混有一些雜細胞，一般傳到第3代時，雜細胞逐漸減少。小鼠胚胎成纖維細胞為梭狀；但連成片時，細胞互相交聯(lián)，形態(tài)不典型。
應(yīng)用[4][5]
用于Ptpn11E76K激活突變協(xié)同miR-100失活促進小鼠胚胎成纖維細胞的惡性轉(zhuǎn)化研究
用小鼠胚胎成纖維細胞研究Ptpn11編碼的SHP-2蛋白激活突變調(diào)控腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)機制,并尋找改善患者預(yù)后的新型靶向腫瘤標志物。SHP-2是一種普遍存在的非受體蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）,該PTP包括兩個串聯(lián)Src同源結(jié)構(gòu)域（N-SH2和C-SH2）,它們起磷酸酪氨酸結(jié)合域的作用,并介導(dǎo)該PTP與底物相互作用,在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。SHP-2的功能失調(diào)能夠誘發(fā)Noonan綜合征、白血病、肺癌等。
前期研究發(fā)現(xiàn),SHP-2激活突變不僅增強細胞擴散及血管生成,而且能夠調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展中起重要作用的RAS-RAF等信號異常活化;還發(fā)現(xiàn)其突變增加了小鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生。micro RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA（約22個核苷酸）,它與其靶基因3’-UTR區(qū)結(jié)合,降解靶mRNA或抑制其翻譯,參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,從而在許多人類癌癥中異常表達并發(fā)揮作用。我們前期在砷誘導(dǎo)的SHP-2 D61G功能性突變的小鼠胚胎成纖維細胞中做基因芯片檢測多種miRNA表達譜發(fā)現(xiàn)miR-100的表達顯著下降。研究發(fā)現(xiàn)miR-100參與調(diào)控多種細胞過程,在許多惡性腫瘤中異常表達并發(fā)揮作用。
方法：1.取13.5d不同基因型的孕鼠制備原代小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）,通過相應(yīng)胚胎組織的基因型鑒定后得到所需的MEFs并且純化。
2. 用表達Cre重組酶的腺病毒（Ad-Cre-GFP）同時感染制備的四組MEF細胞。在Cre重組酶作用下,能夠?qū)76K前面的neo基因盒子敲除,從而表達E76K;并且Cre重組酶還可以利用識別loxp位點切除miR-100,實現(xiàn)miR-100功能失活。因此得到Ptpn11E76K突變和miR-100失活的MEF細胞株,進一步通過熒光定量PCR檢測各組細胞中Cre,SHP-2,miR-100的表達情況來驗證轉(zhuǎn)染效率。
3. 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色和相關(guān)細胞行為學(xué)實驗檢測Ptpn11E76K激活突變和miR-100失活對MEF細胞的生物學(xué)行為的影響:a.增殖實驗:MTT,Ki67的免疫熒光和流氏細胞術(shù),細胞周期分析b.細胞集落生長能力:平板克隆c.細胞非錨定生長情況:軟瓊脂集落形成d.遷移和侵襲能力:Transwell實驗,劃痕實驗；
4.體內(nèi)實驗,建立裸鼠移植瘤模型檢測四組MEF細胞在裸鼠體內(nèi)增殖情況并將移植瘤接種在C57/BL6小鼠皮下進行傳代培養(yǎng)。
參考文獻
[1]An overview of microRNAs:Biology,functions,therapeutics,and analysis methods[J].Kioomars Saliminejad,Hamid Reza Khorram Khorshid,Shahrzad Soleymani Fard,Seyed Hamidollah Ghaffari.Journal of Cellular Physiology.2019(5)
[2]Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].Freddie Bray BSc,MSc,PhD,Jacques Ferlay ME,Isabelle Soerjomataram MD,MSc,PhD,Rebecca L.Siegel MPH,Lindsey A.Torre MSPH,Ahmedin Jemal PhD,DVM.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2018(6)
[3]The gain‐of‐function mutation E76K in SHP2 promotes CAC tumorigenesis and induces EMT via the Wnt/β‐catenin signaling pathway[J].Qian Zhang,Yao Li,Rongrong Zhao,Xinyi Wang,Chuling Fan,Youzhi Xu,Yakun Liu,Jiabin Li,Siying Wang.Molecular Carcinogenesis.2018(5)
[4]Telomere-driven diseases and telomere-targeting therapies[J].Paula Marti?nez,Maria A.Blasco.The Journal of Cell Biology.2017(4)
[5]岳凌霄.Ptpn11~(E76K)激活突變協(xié)同miR-100失活促進小鼠胚胎成纖維細胞的惡性轉(zhuǎn)化[D].安徽醫(yī)科大學(xué),2020.