背景^[1-3]

上皮中性粒細胞激活肽78(ENA78)重組蛋白是將ENA78基因通過基因工程轉入大腸桿菌表達體系內表達出的重組蛋白。

重組蛋白其獲得途徑可以分為體外方法和體內方法。兩種方法的前提都是應用基因重組技術，獲得連接有可以翻譯成目的蛋白的基因片段的重組載體，之后將其轉入可以表達目的蛋白的宿主細胞從而表達特定的重組蛋白分子。

以利用轉基因動物的乳腺表達重組蛋白為例：其方法是將藥用蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調控組件重組在一起，通過顯微注射等方法，導入哺乳動物（哺乳動物才會泌乳）的受精卵中，然后，將受精卵送入母體內，使其生長發(fā)育成轉基因動物。轉基因動物進入泌乳期后，可以通過分泌的乳汁來生產所需要的蛋白質藥品，因而稱為動物乳腺生物反應器或乳房生物反應器。科學家已在牛和山羊等動物的乳腺生物反應器中表達出了抗凝血酶、血清白蛋白、生長激素和α-抗胰蛋白酶等重要的醫(yī)藥產品。

當前重組蛋白的生產主要有四大系統(tǒng);1.原核表達系統(tǒng)：最常用的大腸桿菌蛋白表達，真核表達系統(tǒng)如酵母，哺乳動物細胞蛋白表達（常用的細胞CHO，HEK293）及、昆蟲細胞蛋白表達系統(tǒng)。重組蛋白的產生尚可利用轉基因動物的乳腺或者植物產生，產生的重組蛋白作為生物制藥的產物，在醫(yī)學中作用顯著。

上皮中性粒細胞激活肽78(ENA78)

上皮中性粒細胞激活肽78(ENA78)重組蛋白方法

1.載體構建和細菌培養(yǎng)

1)采用RT-PCR擴增得到目的基因,構建到表達載體(PGEX-4T-1)上;

2)用構建質粒轉化表達菌BL21,LB平板37℃;

3)LB平板上挑取單一菌落接入5mL LB培養(yǎng)基(100ug/mL Amp)中,37℃培養(yǎng)3~5h;

4)將5mL菌液接入1L LB(100ug/mL Amp)液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至OD60≈0.6,加入0.3mmol/L的IPTG,

5)16℃誘導16h;

6)將培養(yǎng)好的菌液于5000r/min離心10min,棄去上清液,收集菌體,離心后菌體沉淀懸浮于25mL Binding buffer中。

2.細胞破碎和蛋白分離

1)往懸浮好的菌液中加入適量蛋白抑制劑(10uL的10mg/mL antipain,10uL的10mg/mL leupeptin和1mL

2)的1mol/L PMSF),冰浴放置;

3)超聲破碎,每個循環(huán)26次,超聲6s,間隔5s,視破碎效果共2~4個循環(huán),破碎后的菌體4℃1800r/min

4)離心30min,上清保持在4℃;

5)GST柱先用PBS緩沖液平衡,上樣結合30~60min,每5~10min攪拌一次,流干;

6)用2~3倍體積PBS緩沖液平衡清洗非特異性蛋白,流干,加入15mL洗脫緩沖液洗脫;

7)由于殘存少量蛋白酶,洗脫出來的目的蛋白溶液可于4℃保存幾小時;

8)SDS-PAGE檢測初步純化效果,進行下一步純化步驟。

應用^[4][5]

用于上皮來源的中性粒細胞激活肽-78與慢性阻塞性肺疾病的相關性研究

通過測定慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者痰誘導液中上皮來源的中性粒細胞激活肽-78（ENA-78）的表達水平,探討上皮來源的中性粒細胞激活肽-78在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病機制中可能的作用。

方法應用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）,檢測38例COPD患者（急性加重期21例,穩(wěn)定期17例）痰誘導液中ENA-78的濃度,并與健康人20例進行比較,分析ENA-78與COPD的關系及相關性。結果與穩(wěn)定期組和正常組比較,COPD急性加重期組的中性粒細胞明顯增多（P＜0.01）;COPD急性加重期患者痰誘導液中ENA-78的表達（145.24±10.39ng/L）明顯高于另外兩組[COPD穩(wěn)定期（74.22±23.15 ng/L）,健康組（70.51±22.44 ng/L）],差異有顯著性（P＜0.001）。

結論ENA-78參與了COPD的炎癥過程,在COPD急性加重期的發(fā)病機制中起重要作用。在COPD急性加重期ENA-78對中性粒細胞的募集起重要作用。

參考文獻

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[2]Chemokine Receptors in Airway Disease:Which Receptors to Target?[J].Charles Owen.Pulmonary Pharmacology&Therapeutics.2001(3)

[3]Monocyte chemoattractant protein 1,interleukin 8,and chronic airways inflammation in COPD[J].Willem I.de Boer,Jacob K.Sont,Annemarievan Schadewijk,JanStolk,J.Hanvan Krieken,Pieter S.Hiemstra.J.Pathol..2000(5)

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[5]盛寶巍.上皮來源的中性粒細胞激活肽-78與慢性阻塞性肺疾病的相關性研究[D].蘭州大學,2009.