背景^[1-3]

ROSETTA 2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞是來(lái)源于Origami 2系列菌株。而Origami 2系列菌株是卡那敏感的K-12細(xì)胞菌株，攜帶有TrxB和Gor基因突變提高含二硫鍵正確折疊蛋白的高效表達(dá)。

本菌株含有pRARE2質(zhì)粒，除了能夠提供原Rosetta(DE3)宿主菌含有的AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,和GGA六個(gè)稀有密碼子的tRNA外，還提供了第七個(gè)稀有密碼子CGG的tRNA。同時(shí)，pRARE2質(zhì)粒具有氯霉素抗性。通過(guò)提供原本在大腸桿菌中稀少的真核細(xì)胞密碼子，增加了真核細(xì)胞的在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)水平。

ROSETTA 2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞

Rosetta-gami 2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中的Gor基因突變使得菌株具有四環(huán)素抗性。

DE3是溶源性的λDE3,所以帶有T7 RNA聚合酶的染色體拷貝。該菌株適用于pET系列載體，及其他T7啟動(dòng)子系列載體。

使用方法

1.從-20°C冰箱中取出Nano E.coli Transfection Reagent徹底融化，放置于冰上。

注意：該試劑含長(zhǎng)鏈帶電化合物，允許反復(fù)凍融20次，使用完畢后繼續(xù)-20°C保存。

2.取50μl Nano E.coli Transfection Reagent置于0.2 ml EP管中，加入10～100 ng質(zhì)粒DNA（不可使用連接產(chǎn)物），槍頭吹打混合均勻，冰上放置2min。

注意：放置時(shí)間不要超過(guò)30min，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致核酸聚合，從而影響轉(zhuǎn)化效價(jià)。

3.將上述混合物（50μl Nano E.coli Transfection Reagent和質(zhì)粒DNA）加入到一支RTS表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞干粉中，槍頭輕輕吹打，徹底溶解細(xì)胞干粉，置于冰上15min。

注意：使用RTS表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞干粉前，輕甩干粉至管底部，如果發(fā)現(xiàn)干粉已經(jīng)溶解則不可使用。

4.置于42°C熱激1min后，迅速置于冰上急冷2min。

5.將熱激完畢的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有450μl不含抗生素的SOC（或LB）培養(yǎng)基，37°C振蕩（225 rpm）培養(yǎng)60min。使質(zhì)粒上抗性標(biāo)記基因表達(dá)，菌體復(fù)蘇。

6.取200μl復(fù)蘇菌液涂布到含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板表面。

7.將平板置于37°C培養(yǎng)，12~18小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。

8.獲得的表達(dá)菌，可使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，從而獲得重組蛋白。

應(yīng)用^[4][5]

用于葡萄根瘤蚜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）基因的克隆、表達(dá)及功能分析研究

以葡萄根瘤蚜為研究對(duì)象,對(duì)其谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行基因克隆獲得了7個(gè)胞質(zhì)型Dvi GSTs,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了原核表達(dá)、蛋白純化、重組蛋白的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定、抗氧化能力檢測(cè)以及農(nóng)藥對(duì)重組蛋白的離體抑制測(cè)定。

結(jié)果如下:1、基因克隆:克隆獲得了7個(gè)胞質(zhì)型Dvi GSTs,分別為Dvi GSTd1、Dvi GSTd2、Dvi GSTt1、Dvi GSTo1、Dvi GSTs1、Dvi GSTs2和Dvi GSTs3,分屬于四個(gè)不同的家族,即Delta、Theta、Omega和Sigma,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證各基因的序列與NCBI中序列一致。7個(gè)GSTs基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度范圍為606-717 bp,編碼201-238個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為58.73-70.22 KD,理論等電點(diǎn)范圍為5.15-5.23。

2、原核表達(dá)及蛋白純化:通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)得到p ET28a（+）-Dvi GSTs重組表達(dá)質(zhì)粒,后轉(zhuǎn)入Rosetta gami 2（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中成功構(gòu)建表達(dá)菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及Ni柱純化,最終獲得了7個(gè)25-40 k D大小的可溶性目的蛋白。

3、Dvi GSTs的酶學(xué)特性分析:Dvi GSTs1的米氏常數(shù)Km最小,Dvi GSTt1的米氏常數(shù)Km;通過(guò)不同家族之間的對(duì)比發(fā)現(xiàn),Delta家族中的Dvi GSTd1和Dvi GSTd2均表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性,Vmax值最低的為Dvi GSTo1。

4、Dvi GSTs的抗氧化性分析:檢測(cè)7個(gè)Dvi GSTs的抗氧化活性?xún)H發(fā)現(xiàn)Sigma家族中Dvi GSTs2和Dvi GSTs3具有抗氧化性,且Dvi GSTs3的抗氧化性高于Dvi GSTs2。

5、Dvi GSTs的離體抑制分析:測(cè)定GSTs結(jié)構(gòu)專(zhuān)性抑制劑及殺蟲(chóng)劑啶蟲(chóng)脒和氟蟲(chóng)腈對(duì)重組蛋白Dvi GSTs的活性抑制率。發(fā)現(xiàn)7個(gè)Dvi GSTs中僅有Dvi GSTd1、Dvi GSTd2、Dvi GSTs1的活性表現(xiàn)出能被藥劑抑制。且殺蟲(chóng)劑啶蟲(chóng)脒和氟蟲(chóng)腈雖然對(duì)Dvi GSTd1、Dvi GSTd2、Dvi GSTs1表現(xiàn)出一定的抑制活性,但效果遠(yuǎn)不及GSTs結(jié)構(gòu)專(zhuān)性抑制劑。

參考文獻(xiàn)

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[5]孫曉.葡萄根瘤蚜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）基因的克隆、表達(dá)及功能分析[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2020.DOI:10.27409/d.cnki.gxbnu.2020.001254.