背景[1-3]
ROSETTA 2(DE3)感受態(tài)細胞是來源于Origami 2系列菌株。而Origami 2系列菌株是卡那敏感的K-12細胞菌株，攜帶有TrxB和Gor基因突變提高含二硫鍵正確折疊蛋白的高效表達。
本菌株含有pRARE2質(zhì)粒，除了能夠提供原Rosetta(DE3)宿主菌含有的AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,和GGA六個稀有密碼子的tRNA外，還提供了第七個稀有密碼子CGG的tRNA。同時，pRARE2質(zhì)粒具有氯霉素抗性。通過提供原本在大腸桿菌中稀少的真核細胞密碼子，增加了真核細胞的在大腸桿菌中的蛋白表達水平。
ROSETTA 2(DE3)感受態(tài)細胞
Rosetta-gami 2(DE3)感受態(tài)細胞中的Gor基因突變使得菌株具有四環(huán)素抗性。
DE3是溶源性的λDE3,所以帶有T7 RNA聚合酶的染色體拷貝。該菌株適用于pET系列載體，及其他T7啟動子系列載體。
使用方法
1.從-20°C冰箱中取出Nano E.coli Transfection Reagent徹底融化，放置于冰上。
注意：該試劑含長鏈帶電化合物，允許反復凍融20次，使用完畢后繼續(xù)-20°C保存。
2.取50μl Nano E.coli Transfection Reagent置于0.2 ml EP管中，加入10～100 ng質(zhì)粒DNA（不可使用連接產(chǎn)物），槍頭吹打混合均勻，冰上放置2min。
注意：放置時間不要超過30min，過長時間會導致核酸聚合，從而影響轉(zhuǎn)化效價。
3.將上述混合物（50μl Nano E.coli Transfection Reagent和質(zhì)粒DNA）加入到一支RTS表達感受態(tài)細胞干粉中，槍頭輕輕吹打，徹底溶解細胞干粉，置于冰上15min。
注意：使用RTS表達感受態(tài)細胞干粉前，輕甩干粉至管底部，如果發(fā)現(xiàn)干粉已經(jīng)溶解則不可使用。
4.置于42°C熱激1min后，迅速置于冰上急冷2min。
5.將熱激完畢的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到含有450μl不含抗生素的SOC（或LB）培養(yǎng)基，37°C振蕩（225 rpm）培養(yǎng)60min。使質(zhì)粒上抗性標記基因表達，菌體復蘇。
6.取200μl復蘇菌液涂布到含相應抗生素的LB瓊脂平板表面。
7.將平板置于37°C培養(yǎng)，12~18小時后可出現(xiàn)菌落。
8.獲得的表達菌，可使用IPTG進行誘導表達，從而獲得重組蛋白。
應用[4][5]
用于葡萄根瘤蚜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）基因的克隆、表達及功能分析研究
以葡萄根瘤蚜為研究對象,對其谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶進行基因克隆獲得了7個胞質(zhì)型Dvi GSTs,并在此基礎(chǔ)上進行了原核表達、蛋白純化、重組蛋白的酶動力學參數(shù)測定、抗氧化能力檢測以及農(nóng)藥對重組蛋白的離體抑制測定。
結(jié)果如下:1、基因克隆:克隆獲得了7個胞質(zhì)型Dvi GSTs,分別為Dvi GSTd1、Dvi GSTd2、Dvi GSTt1、Dvi GSTo1、Dvi GSTs1、Dvi GSTs2和Dvi GSTs3,分屬于四個不同的家族,即Delta、Theta、Omega和Sigma,經(jīng)測序驗證各基因的序列與NCBI中序列一致。7個GSTs基因開放閱讀框長度范圍為606-717 bp,編碼201-238個氨基酸,分子質(zhì)量為58.73-70.22 KD,理論等電點范圍為5.15-5.23。
2、原核表達及蛋白純化:通過構(gòu)建原核表達系統(tǒng)得到p ET28a（+）-Dvi GSTs重組表達質(zhì)粒,后轉(zhuǎn)入Rosetta gami 2（DE3）感受態(tài)細胞中成功構(gòu)建表達菌。經(jīng)IPTG誘導表達及Ni柱純化,最終獲得了7個25-40 k D大小的可溶性目的蛋白。
3、Dvi GSTs的酶學特性分析:Dvi GSTs1的米氏常數(shù)Km最小,Dvi GSTt1的米氏常數(shù)Km;通過不同家族之間的對比發(fā)現(xiàn),Delta家族中的Dvi GSTd1和Dvi GSTd2均表現(xiàn)出較強的活性,Vmax值最低的為Dvi GSTo1。
4、Dvi GSTs的抗氧化性分析:檢測7個Dvi GSTs的抗氧化活性僅發(fā)現(xiàn)Sigma家族中Dvi GSTs2和Dvi GSTs3具有抗氧化性,且Dvi GSTs3的抗氧化性高于Dvi GSTs2。
5、Dvi GSTs的離體抑制分析:測定GSTs結(jié)構(gòu)專性抑制劑及殺蟲劑啶蟲脒和氟蟲腈對重組蛋白Dvi GSTs的活性抑制率。發(fā)現(xiàn)7個Dvi GSTs中僅有Dvi GSTd1、Dvi GSTd2、Dvi GSTs1的活性表現(xiàn)出能被藥劑抑制。且殺蟲劑啶蟲脒和氟蟲腈雖然對Dvi GSTd1、Dvi GSTd2、Dvi GSTs1表現(xiàn)出一定的抑制活性,但效果遠不及GSTs結(jié)構(gòu)專性抑制劑。
參考文獻
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[2]Insect cuticle:a critical determinant of insecticide resistance[J].Vasileia Balabanidou,Linda Grigoraki,John Vontas.Current Opinion in Insect Science.2018
[3]Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies,Musca domestica[J].Xuechun Feng,Ming Li,Nannan Liu.Insect Biochemistry and Molecular Biology.2018
[4]Expression profiles of glutathione S‐transferase superfamily in Spodoptera litura tolerated to sublethal doses of chlorpyrifos[J].Ni Zhang,Jia Liu,Shu‐Na Chen,Li‐Hua Huang,Qi‐Li Feng,Si‐Chun Zheng.Insect Science.2016(5)
[5]孫曉.葡萄根瘤蚜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）基因的克隆、表達及功能分析[D].西北農(nóng)林科技大學,2020.DOI:10.27409/d.cnki.gxbnu.2020.001254.