背景^[1-3]

梭菌強(qiáng)化培養(yǎng)基用于梭菌的增菌培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。成分(g/L)：蛋白胨10.0；牛肉粉10.0；酵母粉3.0；葡萄糖5.0；可溶性淀粉1.0；氯化鈉5.0；醋酸鈉3.0；L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5；瓊脂0.5；pH值6.8±0.1，25℃。

原理：蛋白胨、牛肉浸粉、酵母粉、可溶性淀粉和L-半胱氨酸鹽酸鹽提供碳源、氮源、維生素和生長(zhǎng)因子；葡萄糖為可發(fā)酵糖類(lèi)；氯化鈉維持均衡的滲透壓；醋酸鈉可抑制革蘭氏陰性菌；微量瓊脂（0.5g）增加了其還原環(huán)境的穩(wěn)定性，可以防止液體對(duì)流，即防止二氧化碳、氧氣和還原產(chǎn)物的擴(kuò)散，有利于厭氧環(huán)境的形成；無(wú)動(dòng)力的細(xì)菌在此培養(yǎng)基中呈顆粒狀或條狀生長(zhǎng)，可進(jìn)行計(jì)數(shù)；有動(dòng)力的細(xì)菌在培養(yǎng)基中通常呈渾濁生長(zhǎng)，一般不能計(jì)數(shù)。

梭菌強(qiáng)化培養(yǎng)基

用法：稱取本品38.0g,加熱攪拌溶解于1000ml蒸餾水中,分裝,121℃高壓滅菌15分鐘,備用。

梭菌屬是一群革蘭陽(yáng)性菌，能產(chǎn)生芽孢，對(duì)外界抵抗力強(qiáng)。因芽孢直徑大于菌體寬度,使菌體膨大呈梭形,因而得名。其廣泛分布于自然界中，存在于土壤、人和動(dòng)物腸道中。多數(shù)為非致病菌，少數(shù)為致病菌。常見(jiàn)致病厭氧芽孢梭菌主要有破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌等。

應(yīng)用^[4][5]

用于丙丁梭菌工程菌株的代謝調(diào)控及其高強(qiáng)度丁醇發(fā)酵研究

基于木質(zhì)纖維素水解液可發(fā)酵糖利用差異及抑制物脅迫的實(shí)際問(wèn)題,利用前期工作構(gòu)建的多株丙丁梭菌工程菌株,圍繞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控、木糖轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)化調(diào)控開(kāi)展丙丁梭菌代謝調(diào)控及高強(qiáng)度丁醇發(fā)酵研究。

一方面,利用葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glc G過(guò)表達(dá)的工程菌株,通過(guò)結(jié)合p H調(diào)控與人工電子載體擾動(dòng)策略,分別在細(xì)胞能量代謝與氧化還原代謝水平進(jìn)行持續(xù)強(qiáng)化,提高胞內(nèi)ATP與NADH周轉(zhuǎn)再生,促進(jìn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)與丁醇合成。在優(yōu)化條件下,以葡萄糖為底物的批次發(fā)酵周期僅24小時(shí),丁醇產(chǎn)量與生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到了18.3 g/L與0.76 g/L/h,較對(duì)照菌株提高55%與280%。

以未脫毒秸稈水解液為底物的批次發(fā)酵周期也為36小時(shí),丁醇產(chǎn)量與生產(chǎn)強(qiáng)度均提高了320%。另一方面,利用木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Xyl T、木糖脫氫酶Xyl B與木酮糖內(nèi)酯酶Xyl C協(xié)同過(guò)表達(dá)的工程菌株,木糖轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)化為木糖酸,同時(shí)補(bǔ)充胞內(nèi)關(guān)鍵輔因子NADH,并通過(guò)p H調(diào)控策略,實(shí)現(xiàn)了葡萄糖與木糖高效同步利用與丁醇合成強(qiáng)化。在優(yōu)化條件下,以葡萄糖和木糖混合碳源為底物的批次發(fā)酵周期僅24小時(shí),丁醇產(chǎn)量與生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到了12.0 g/L與0.50 g/L/h,較對(duì)照菌株提高16%與194%。

以未脫毒秸稈水解液為底物的批次發(fā)酵周期同樣為24小時(shí),丁醇產(chǎn)量與生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了300%與610%。上述研究結(jié)果表明,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控與木糖轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)化調(diào)控能夠?qū)崿F(xiàn)高強(qiáng)度丁醇發(fā)酵,有效解決木質(zhì)纖維素水解液可發(fā)酵糖利用差異及抑制物脅迫的實(shí)際問(wèn)題。

更進(jìn)一步地,為解決SSF中存在的纖維素酶酶解與ABE發(fā)酵溫度不匹配的實(shí)際問(wèn)題,本論文研究工作從菌株耐熱性入手,分別利用葡萄糖合成培養(yǎng)基與未脫毒酸解液,重點(diǎn)考察了上述工程菌株的高溫脅迫耐受性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glc G過(guò)表達(dá)菌株在39-45℃具有更好的高溫耐受性和丁醇發(fā)酵性能,其在42℃發(fā)酵條件下的丁醇及ABE產(chǎn)量仍維持在10.4 g/L與18.2 g/L,為建立高溫SSF工藝提供了必要條件。在42℃及預(yù)糖化12小時(shí)條件下,該工程菌株利用脫毒后的預(yù)處理秸稈物料,丁醇產(chǎn)量及生產(chǎn)強(qiáng)度分別為10.5 g/L與0.18 g/L/h,相對(duì)于傳統(tǒng)SSF工藝,生產(chǎn)效率大幅提升,對(duì)于提高纖維素丁醇的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性和競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。