背景及概述^[1][2]

9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺（簡稱Fmoc-ONSu）是一種無色或淺黃色針狀晶體，分子式C19H15NO5，分子量337.3。9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺主要用于多肽合成的產(chǎn)品中用于保護(hù)氨基酸的加工，其是氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一種有機(jī)化合物，通過對多肽的合成過程研究發(fā)現(xiàn)其已經(jīng)成為當(dāng)前生物化學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向之一。

制備^[1]

現(xiàn)有的多肽合成普遍采用固相或合成法，其一方面進(jìn)行合成時(shí)原材料消耗好大且合成設(shè)備價(jià)格昂貴，加工合成效率低、純度低，合成反應(yīng)過程較復(fù)雜、不易分離；另一方面合成所使用的設(shè)備價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本投入較高，無法滿足中小企業(yè)進(jìn)行加工合成的需求。因此，基于上述問題，CN201310271359.8提供一種用于9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺制備方法。

本發(fā)明目的為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺制備方法，一方面能夠極大的提高合成生產(chǎn)效率、合成產(chǎn)品純度，另一方面合成所使用的設(shè)備價(jià)格適中，能夠滿足中小企業(yè)要求。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供一種用于9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺制備方法，包括以下步驟，

步驟1、首先將質(zhì)量比為1:3-4的芴甲氧羰酰氯甲酸酯和琥珀酸亞氨水溶液

作為原料，然后將反應(yīng)溫度控制在40℃-60℃，緩慢攪拌反應(yīng)10m-30m即得到反應(yīng)液；

步驟2、在步驟1的反應(yīng)液中加入無機(jī)堿并攪拌反應(yīng)，其中無機(jī)堿為碳酸鈉或碳酸氫鈉質(zhì)量比是琥珀酸亞氨水溶液的2-4倍；

步驟3、將步驟3制得的反應(yīng)溶液進(jìn)行過濾、洗滌、烘干后即得9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺，其中烘干溫度為30℃-80℃。

優(yōu)選的所述步驟1中芴甲氧羰酰氯甲酸酯溶液的濃度為7％-10％。

優(yōu)選的所述步驟1中琥珀酸亞氨水溶液的濃度為6％-9％。

優(yōu)選的所述步驟1中反應(yīng)溫度為45℃-55℃，反應(yīng)時(shí)間15 m -20 m。

優(yōu)選的所述步驟2中無機(jī)堿為碳酸鈉或碳酸氫鈉質(zhì)量比是琥珀酸亞氨水溶液的2.5-3倍。

優(yōu)選的所述步驟3中烘干溫度為50℃-60℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明的一種用于9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺制備方法，解決了現(xiàn)有加工合成效率低、純度低和方法復(fù)雜的的問題，能夠快速、簡單的加工合成出純度高的9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺：同時(shí)加工合成所使用的設(shè)備價(jià)格適中，滿足了中小企業(yè)加工合成需要，降低了企業(yè)生產(chǎn)成本投入。

檢測方法^[2]

9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺是有機(jī)合成的重要原料，目前主要用作肽合成和抗血栓類藥物中間體。目前對Fmoc-ONSu的合成和應(yīng)用的研究報(bào)道較多，但還沒有公開資料介紹Fmoc-ONSu的分析方法。盡管已有文獻(xiàn)或?qū)＠岬紽moc-ONSu合成產(chǎn)物的液相色譜含量，但對液相色譜的詳細(xì)操作條件都沒有公開，對于采用哪種類型的高效液相色譜柱及具體操作條件都有待詳細(xì)摸索。

目前常用的方法是進(jìn)行柱前或柱后衍生，即試樣先和衍生化試劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的具有紫外生色團(tuán)或熒光團(tuán)的衍生化產(chǎn)物，再通過紫外光或熒光檢測器獲得相應(yīng)的響應(yīng)，從而可檢測出試樣的實(shí)際含量。這種方法雖然理論上可以用來測定Fmoc-ONSu的真實(shí)含量，但衍生劑稀少，操作手續(xù)繁瑣，有較大缺陷。

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種操作方便、測定準(zhǔn)確的液相色譜檢測方法，本發(fā)明公開了一種9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺純度的液相色譜測定方法。

本發(fā)明通過如下技術(shù)方案達(dá)到發(fā)明目的：

一種9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺純度的液相色譜測定方法，采用高效液相色譜儀操作，其特征是：按如下方法依次實(shí)施：

a. 設(shè)置高效液相色譜儀：高效液相色譜儀的色譜柱作為固定相，固定相為反相鍵合固定相，即色譜柱的填料選用十八烷基鍵合相硅膠、辛烷基鍵合相硅膠和氰基鍵合相硅膠中的任意一種，填料的粒徑不大于5μm，色譜柱的長度為10cm～50cm，色譜柱的內(nèi)徑為4mm～5mm；

高效液相色譜儀的流動相選用水、乙腈、四氫呋喃、環(huán)己烷、正己烷、乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷和甲苯中的任意一種；

高效液相色譜儀的檢測器采用多波長可變紫外-可見光檢測器，檢測器所發(fā)射的紫外線的波長在220nm～370nm；

b. 配制標(biāo)樣溶液：以色譜純的流動相為溶劑，用容量瓶等儀器將9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺的標(biāo)樣配制成濃度為0.1mg/mL～1.2mg/mL的溶液作為分析用標(biāo)樣，配制時(shí)用超聲波脫氣溶解并將溶液混合搖勻后作為分析用標(biāo)樣；

c. 配制待測樣品溶液：以色譜純的流動相為溶劑，用容量瓶等儀器將含有9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺的待測樣品配制成濃度為0.1mg/mL～1.2mg/mL的溶液作為待分析的試樣，配制時(shí)用超聲波脫氣溶解并將溶液混合搖勻后作為分析用標(biāo)樣；

d. 分析標(biāo)樣：待高效液相色譜儀條件穩(wěn)定后，用高效液相色譜儀分析標(biāo)樣，用50μL容量的微量注射器向高效液相色譜儀內(nèi)注入標(biāo)樣，標(biāo)樣各組分得以分離后，得出標(biāo)樣中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺組分的峰面積；

e. 分析試樣：待高效液相色譜儀條件穩(wěn)定后，用高效液相色譜儀分析試樣，用50μL容量的微量注射器向高效液相色譜儀內(nèi)注入試樣，試樣各組分得以分離后，得出試樣中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺組分的峰面積；

f. 計(jì)算純度：采用外標(biāo)法以標(biāo)樣定量試樣的純度，待測樣品中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺的純度，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，按下式計(jì)算：

X1：試樣中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺的純度，以百分比表示，

X0：標(biāo)樣中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺的純度，以百分比表示，

A1：試樣中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺組分的峰面積，

A0：標(biāo)樣中9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺組分的峰面積，

m1：試樣的質(zhì)量，

m0：標(biāo)樣的質(zhì)量。

采用外標(biāo)法分析過程快捷，方便、易操作，分析結(jié)果誤差小，得到的色譜峰峰形尖銳、對稱性好，可作為9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺合成及提純過程中的純度檢測，即適用于各種純度的9-芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺樣品。

主要參考資料

[1] CN201310271359.8

[2]CN201310683256.2