背景[1-3]
BT-325人腦多型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞于1985年由北京神經(jīng)外科研究所建立，來源于一例人腦多型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的成纖維細(xì)胞樣貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)基:RPMI 1640，90%；FBS，10%。生長條件：氣相空氣，95%；二氧化碳，5%;溫度：37℃。
BT-325人腦多型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞
培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類；
1.細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
應(yīng)用[4][5]
用于EphA2基因表達(dá)及其對人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤生物學(xué)特性的影響研究
探討了EphA2分子誘導(dǎo)高表達(dá)和干涉表達(dá)對于星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞體外增殖、侵襲、凋亡、FAK磷酸化以及裸鼠致瘤性的影響,為發(fā)現(xiàn)EphA2分子在腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性進(jìn)展中的作用提供了實驗基礎(chǔ)。
EphA2在人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse-transcription PCR,RT-PCR）檢測EphA2 mRNA在4株人腦星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U251、U87、BT325和SHG44）、90例人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織和10例正常人腦組織中的表達(dá)水平。
結(jié)果顯示,EphA2 mRNA在U251、U87、SHG44細(xì)胞中均有表達(dá);而BT325細(xì)胞未見EphA2 mRNA表達(dá)。90例人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本中,共有43例（47.8%）表達(dá)EphA2 mRNA;10例正常人腦組織均未見EphA2 mRNA表達(dá)。EphA2 mRNA表達(dá)陽性率在人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤及正常人腦組織之間存在顯著差異（P<0.01）。EphA2 mRNA表達(dá)陽性率隨腫瘤標(biāo)本病理級別增高而增高（P<0.05）。
EphA2 mRNA表達(dá)陽性率與患者性別、年齡、腫瘤大小及部位無關(guān)（P均>0.05）。采用免疫熒光法檢測EphA2蛋白在4株人腦星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U251、U87、BT325和SHG44）中的表達(dá)。
結(jié)果顯示,EphA2蛋白在U251、U87及SHG44細(xì)胞中均有高表達(dá),在BT325細(xì)胞中未見表達(dá)。EphA2蛋白陽性染色多定位于細(xì)胞胞漿。
分別采用免疫組化SABC法和凋亡原位檢測法（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL）檢測90例人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織、10例正常人腦組織中EphA2蛋白、Ki67蛋白表達(dá)以及細(xì)胞凋亡水平。
結(jié)果顯示,43.3%（39/90）腫瘤標(biāo)本表達(dá)EphA2蛋白,而正常人腦組織未見EphA2蛋白表達(dá)。
參考文獻(xiàn)
[1]EphA2 as a target for ovarian cancer therapy[J].Landen,Kinch,Sood.Expert Opinion on Therapeutic Targets.2005(6)
[2]EphA2 as a Glioma-Associated Antigen:A Novel Target for Glioma Vaccines[J].Manabu Hatano,Junichi Eguchi,Tomohide Tatsumi,Naruo Kuwashima,Jill E.Dusak,Michel S.Kinch,Ian F.Pollack,Ronald L.Hamilton,Walter J.Storkus,Hideho Okada.Neoplasia.2005(8)
[3]The clinical significance of EphA2 and Ephrin A-1 in epithelial ovarian carcinomas[J].Liping Han,Ziming Dong,Yuhuan Qiao,Gunnar B.Kristensen,Ruth Holm,Jahn M.Nesland,Zhenhe Suo.Gynecologic Oncology.2005(2)
[4]Invasiveness of breast carcinoma cells and transcript profile:Eph receptors and ephrin ligands as molecular markers of potential diagnostic and prognostic application[J].Brian P Fox,Raj P Kandpal.Biochemical and Biophysical Research Communications.2004(4)
[5]李俠.EphA2基因表達(dá)及其對人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤生物學(xué)特性的影響[D].第四軍醫(yī)大學(xué),2007.