背景[1-3]
支原體瓊脂培養(yǎng)基適用于臨床解脲脲原體、支原體分離培養(yǎng)。支原體瓊脂培養(yǎng)基主要由含有適合解脲、人型支原體生長的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和平皿組成。
支原體瓊脂培養(yǎng)基主要組成成份：瓊脂粉3%,純化水70%,尿素0.1%,酪蛋白胨2%,大豆蛋白胨1.5%,精氨酸0.5%,葡萄糖2%。
支原體瓊脂培養(yǎng)基
支原體（mycoplasma）是一類沒有細胞壁、高度多形性、能通過濾菌器、可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小原核細胞型微生物。由于能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。支原體培養(yǎng)是指將支原體接種到培養(yǎng)基中，并觀察其生長情況，以判斷有無支原體感染。
支原體的營養(yǎng)要求比一般細菌高，除基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)外還需加入10%～20%人或動物血清以提供支原體所需的膽固醇和酵母。支原體的最適pH 7.8～8.0之間，低于7.0則死亡，但解脲支原體最適pH 6.0～6.5。
分離培養(yǎng)是支原體實驗室診斷的惟一方法。大多數(shù)支原體兼性厭氧，有些菌株在初分離時加入5%CO2生長更好。生長緩慢，在瓊脂含量較少的固體培養(yǎng)基上孵育2～3天出現(xiàn)典型的“荷包蛋樣”菌落（圓形，直徑10～16μm），核心部分較厚，向下長入培養(yǎng)基，周邊為一層薄的透明顆粒區(qū)。解脲支原體在含尿素和以硫酸錳為產(chǎn)氨指標的完全診斷培養(yǎng)基上生長良好，形成具有特征性的深棕色菌落。
應(yīng)用[4][5]
用于牛支原體PCR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用研究
采集病牛的肺臟、肝、胸腔滲出物等,接種支原體肉湯培養(yǎng)基,同時剪碎病料呈小塊狀或直接接取胸腔滲出液,在20%馬血清瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種,置5%CO2、37℃溫箱中培養(yǎng),5～7d觀察判定。
肉湯培養(yǎng)基中生長初期呈輕微渾濁或呈白色點狀、絲狀生長,以后逐漸均勻渾濁,半透明稍帶乳光,不產(chǎn)生菌膜或沉淀,也無顆粒懸浮。
在20%馬血清瓊脂培養(yǎng)基上生長遲緩,為極小的水滴狀圓形略帶灰色的微細菌落,中央有乳頭狀突起。
姬姆薩染色,顯微鏡觀察,菌落為多形態(tài),以球點狀最常見,大小在125～250 nm。對病牛肺部實變組織進行DNA模板的提取,并分別以牛支原體、無乳支原體、絲狀支原體等為陽性對照,利用支原體通用引物擴增其16SrRNA,建立了擴增16S rRNA序列進行支原體檢測的方法,擴增到16S rRNA的基因片段,大小為1.5kb左右,經(jīng)過測序,并與GenBank公布的支原體16S rRNA基因序列進行比較,分別與幾種支原體陽性樣本的序列同源性均在97-100%。
支原體的培養(yǎng)困難,生長周期長,營養(yǎng)條件苛刻,使其不能作為早期、快速的檢測方法。PCR技術(shù)為DNA體外擴增技術(shù),呈2n放大效應(yīng),可檢測樣品中微量級的DNA,具有高靈敏性,因此適于早期檢測。
對導(dǎo)致牛支原體病的絲狀支原體絲狀亞種、牛支原體、無乳支原體和綿羊肺炎支原體設(shè)計了4對特異引物,建立了多重PCR方法,以期達到快速檢測的目的,試驗具有特異性強,敏感性高的特點,為臨床檢測提供了強有力的技術(shù)支持,為臨床疑似支原體感染病例的鑒別診斷提供較有效的快速診斷方法。
參考文獻
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[5]李彥芹.牛支原體PCR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.