背景[1-3]
強化梭菌培養(yǎng)基(RCM)用于梭菌的增菌培養(yǎng)和計數(shù)。成分(g/L)：蛋白胨10.0牛肉粉10.0酵母粉3.0葡萄糖5.0可溶性淀粉1.0氯化鈉5.0醋酸鈉3.0L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5瓊脂0.5pH值6.8±0.1，25℃厭氧培養(yǎng)。
原理：蛋白胨、牛肉浸粉、酵母粉、可溶性淀粉和L-半胱氨酸鹽酸鹽提供碳源、氮源、維生素和生長因子；葡萄糖為可發(fā)酵糖類；氯化鈉維持均衡的滲透壓；醋酸鈉可抑制革蘭氏陰性菌；微量瓊脂（0.5g）增加了其還原環(huán)境的穩(wěn)定性，可以防止液體對流，即防止二氧化碳、氧氣和還原產(chǎn)物的擴散，有利于厭氧環(huán)境的形成；無動力的細菌在此培養(yǎng)基中呈顆粒狀或條狀生長，可進行計數(shù)；有動力的細菌在培養(yǎng)基中通常呈渾濁生長，一般不能計數(shù)。
強化梭菌培養(yǎng)基(RCM)
用法：稱取本品38.0g,加熱攪拌溶解于1000ml蒸餾水中,分裝,121℃高壓滅菌15分鐘,備用。
梭菌屬呈細胞桿狀，0.3～2.0μm×1.5～2.0μm，常排列成對或短鏈，圓的或漸尖的末端。通常多形態(tài)，幼齡時革蘭氏常呈陽性，以周生鞭毛運動。芽孢橢圓或球形孢囊膨大。大多數(shù)種為化能異養(yǎng)菌；有的化能自養(yǎng)菌或無機化能營養(yǎng)?？梢运馓?、蛋白質(zhì)，或兩者都無或兩者皆有。
它們通常從糖或蛋白胨產(chǎn)生混合的有機酸和醇類。不還原硫酸鹽。接觸酶通常陰性，專性厭氧，如在空氣中生長也是極弱，生孢被抑制。它們的代謝極富多樣性，最適溫度10～65℃。廣泛分布在環(huán)境中，許多種可產(chǎn)生外毒素，有的對動物有毒，由于傷口感染或吸收毒素。
應(yīng)用[4][5]
用于不同來源的艱難梭菌其毒素、MLST分型及藥敏情況的分析研究
對來源于成人和嬰幼兒的艱難梭菌菌株進行相應(yīng)的研究,同時了解這些菌株對目前CDI治療常用抗菌藥物的敏感性及其耐藥基因產(chǎn)生的情況。
方法收集有腹瀉癥狀的成人糞便標(biāo)本675份、及健康嬰幼兒（<2歲）糞便標(biāo)本618份。將新鮮糞便接種于平板培養(yǎng)基上在35℃溫箱厭氧孵育48h,挑選可疑菌落進行兩次耐氧試驗后通過API20A厭氧鑒定條進行鑒定或擴增艱難梭菌16srRNA特異性片段加以鑒定。
16srDNA引物根據(jù)NCBI艱難梭菌參考菌株630設(shè)計。通過PCR方法鑒定所有菌株毒素基因的tcdA、tcdB。同時對毒素基因陽性的菌株進行MLST分型,根據(jù)Griffiths設(shè)計的七對看家基因引物測序,將每一份樣品中測定的7管家基因序列（adk、atpA等）提交到公用數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.Org/Clostridium difficile中比對,獲得相應(yīng)的等位基因譜,然后將等位基因圖譜提交到科克大學(xué)的公開數(shù)據(jù)庫（http://mlst.ucc.ie/mlst/）獲得ST型,若數(shù)據(jù)庫中不存在的型別認為是新的ST型。
將7個等位基因的序列合并成1個大序列,使用clustalx軟件將64個樣品的序列進行Alignment對齊,然后在MEGA7.0上使用Maximum likelihood（ML）法構(gòu)建進化樹。將67株含有毒素基因的艱難梭菌厭氧培養(yǎng)48小時候后,挑取若干菌落將濁度調(diào)到3.0麥?zhǔn)蠁挝?用CDAB檢測試劑條在全自動免疫熒光分析儀上檢測艱難梭菌A/B毒素。
利用測序的方法檢測毒素基因tcdA、tcdB的負調(diào)控基因tcdC的突變位點,分析突變位點與毒素表達的關(guān)系。
同時進行細胞毒素試驗：調(diào)取三株來源于成人毒素基因和毒素檢測都陽性的菌株,與三株來源于兒童毒素基因陽性而毒素表達陰性的菌株,接種到預(yù)制好的10ml腦心浸液肉湯中,厭氧環(huán)境35℃培養(yǎng)48h,離心過濾取上清感染Vero細胞。
將培養(yǎng)基換成含有1/10菌液上清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱里孵育1h,用PBS洗三次之后再換成正常的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,次日在顯微鏡下觀察Vero細胞的形態(tài)。將待測菌培養(yǎng)48h后每個標(biāo)本挑取菌液0.5麥?zhǔn)蠁挝?涂布到提前制備好的布氏瓊脂平板上,再貼上Etest條放于厭氧罐中37℃培養(yǎng)48h。
參考文獻
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[2]Time‐resolved cellular effects induced by TcdA from Clostridium difficile[J].Nelli Jochim,Ralf Gerhard,Ingo Just,Andreas Pich.Rapid Commun.Mass Spectrom..2014(10)
[3]Molecular Epidemiology of Clostridium difficile Infection in a Major Chinese Hospital:an Underrecognized Problem in Asia?[J].Peter M.Hawkey,Clare Marriott,Wen En Liu,Zi Juan Jian,Qian Gao,Thomas Kin Wah Ling,Viola Chow,Erica So,Raphael Chan,Katie Hardy,Li Xu,Susan Manzoor.Journal of Clinical Microbiology.2013(10)
[4]Burden of Clostridium difficile on the Healthcare System[J].Erik R.Dubberke,Margaret A.Olsen.Clinical Infectious Diseases.2012(supp)
[5]陳麗丹.不同來源的艱難梭菌其毒素、MLST分型及藥敏情況的分析[D].南方醫(yī)科大學(xué),2016.