背景及概述^[1]

堿性綠1又叫燦爛綠，燦爛綠屬于堿性三苯甲烷類染料，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用作殺菌劑和抗寄生蟲(chóng)藥，由于三苯甲烷類具有致突變、致畸性和致癌作用，歐美和我國(guó)已嚴(yán)禁在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用三苯甲烷類染料，由于水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中使用了燦爛綠而使池塘水體和土壤受到污染，在后續(xù)的養(yǎng)殖過(guò)程中容易在魚(yú)體內(nèi)形成殘留，因此魚(yú)類養(yǎng)殖需對(duì)池塘水體和土壤進(jìn)行有效的監(jiān)控。

檢測(cè)方法^[1]

土壤中燦爛綠的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

S1.制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

S1a.制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg于50mL燒杯中，用少量乙腈溶解并定容到50mL棕色容量瓶，混勻，濃度為200μg/mL。該溶液可在-18℃條件下保存6個(gè)月。

燦爛綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取燦爛綠標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg于50mL燒杯中，用少量乙腈溶解并定容到50mL棕色容量瓶，混勻，濃度為200μg/mL。該溶液可在-18℃條件下保存6個(gè)月。

S2.制備標(biāo)準(zhǔn)溶液

S2a.從燦爛綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中分別吸取0.5mL至100mL棕色容量瓶中，并用乙腈定容，混勻，濃度為1.0μg/mL，該溶液可在4℃條件下保存1個(gè)月；再吸取0.5mL至50mL棕色容量瓶中，并用乙腈定容，混勻，濃度為0.01μg/mL(該溶液臨用前配制)，得到燦爛綠標(biāo)準(zhǔn)溶液。

從氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中吸取0.5mL至100mL棕色容量瓶中，并用乙腈定容，混勻，得標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度為1.0μg/mL。該溶液可在冰箱中4℃保存1個(gè)月。得到氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液。

S3.制備標(biāo)準(zhǔn)溶液

S3a.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別用50％乙腈水稀釋氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液和燦爛綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，將氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液加入燦爛綠標(biāo)準(zhǔn)溶液中，分別配置0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL及10.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，各含氘代孔雀石綠5.0ng/mL。該溶液臨用現(xiàn)配。

S4.試樣制備

取土壤樣品2.0kg于通風(fēng)處自然風(fēng)干，去除較大的石塊和其它雜質(zhì)，然后過(guò)2.0mm孔徑篩，用均質(zhì)器或研磨器完全搗碎，混合均勻，作為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣品。

S5.燦爛綠提取

準(zhǔn)確稱取10g試樣(精確至0.01g)于80mL離心管內(nèi)，加入1.0μg/mL氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL，加入4mL0.1mol/L乙酸銨緩沖溶液、4mL1.0mol/L對(duì)甲苯磺酸溶液和50mL乙腈，用均質(zhì)機(jī)以10000r/min的速度均質(zhì)30s，4000r/min離心5min，上清液倒入裝有20mL水、40mL二氯甲烷的分液漏斗中，上下震蕩5min，靜置分層，吸掉上層水相，再加入20mL水重復(fù)上述操作，取下層溶液于雞心瓶中，40℃減壓濃縮至干，得樣品液。

樣品液加入10mL乙腈洗脫雞心瓶，取2mL過(guò)活化的中性氧化鋁柱(中性氧化鋁柱上端填1cm高無(wú)水硫酸鈉，使用前用5mL乙腈活化)，收集到150mL棕色雞心瓶中，20mL乙腈洗脫中性氧化鋁柱，洗脫液全部收集到同一雞心瓶中，40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，后用2mL乙腈+水(1+1)溶液渦旋洗脫，取清液用0.2μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，得提取液。

S6.上機(jī)測(cè)試：取5μL提取液注入液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)，具體測(cè)試條件如下：

液相色譜條件：

a、色譜柱：WATERS UPLC BEH C18 1.7μm,100*2.1mm或性能相當(dāng)者

b、流動(dòng)相：乙腈+5mmol/L乙酸銨(含0.1％甲酸)梯度洗脫

c、流速：0.3mL/min

d、進(jìn)樣量：5μL

質(zhì)譜條件：

a、離子源：電噴霧離子源

b、掃描方式：正離子掃描

c、檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)

d、電噴霧電壓：4000V

e、毛細(xì)管電壓：100V

f、輔助器壓力：35psi

g、反吹氣：11L/min

h燦爛綠離子對(duì)：358.3/297.2(定量)358.3/341.2

氘代孔雀石綠離子對(duì)：334.2/318.2

S7.結(jié)果判定：如果同濃度的提取液的色譜峰保留時(shí)間與同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰保留時(shí)間一致。且試樣中目標(biāo)化合物的兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度偏差不超過(guò)允許的相對(duì)偏差，則可判斷樣品中存在燦爛綠。

S8.定量測(cè)量

分別用50％乙腈水稀釋氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液和燦爛綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，將氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液加入燦爛綠標(biāo)準(zhǔn)溶液中，配置0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，各含氘代孔雀石綠5.0ng/mL，以標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，提取液等體積進(jìn)樣測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量；提取液中的燦爛綠含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)。

S9.加標(biāo)回收

采用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)，用1.0mL移液槍添加0.01μg/mL氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL于空白樣品中，即相當(dāng)于添加濃度為0.5μg/kg添加水平。

S10.空白試驗(yàn)

除不稱取樣品外，重復(fù)步驟S5-S6步驟，得空白檢測(cè)液，檢測(cè)空白檢測(cè)液。

S11.結(jié)果計(jì)算

依據(jù)以下公式計(jì)算試樣中燦爛綠的殘留量：

式中：X為土壤中燦爛綠的含量，μg/kg；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出的提取液中目標(biāo)物燦爛綠的含量，ng/mL；V為提取液的體積，mL；m為土壤的稱樣量，g；n為稀釋倍數(shù)。

應(yīng)用^[2]

CN201710400093.0提供了一種可褪色黑墨水及其制備方法，墨水組分按重量百分比計(jì)：紅色染料0.8-0.85％，綠色染料2.5-3.0％，增稠劑3.0-3.5％，表面活性劑1.0-1.5％，防腐劑0.15-0.20％，蒸餾水余量，所述的紅色染料為酸性品紅或堿性品紅；所述的綠色染料為酸性綠、堿性綠或燦爛綠。該墨水制備方法簡(jiǎn)單，原料來(lái)源廣泛，成本較低。該墨水無(wú)毒，無(wú)刺激性氣味，且遇還原性物質(zhì)可褪色，書(shū)寫(xiě)過(guò)的紙張可以回收再利用。

參考文獻(xiàn)

[1] [中國(guó)發(fā)明] CN201910909255.2 土壤中燦爛綠的檢測(cè)方法

[2] CN201710400093.0一種可褪色黑墨水及其制備方