背景[1-3]
MACH1-T1感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌Mach1-T1菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用pUC19質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)109 cfu/µg。
感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建流程
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.Mach1-T1感受態(tài)細(xì)胞是目前生長(zhǎng)速度最快的感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素平板上，8-9小時(shí)可見(jiàn)克??；
2.用于藍(lán)、白斑篩選，12小時(shí)可見(jiàn)藍(lán)斑；
3.將過(guò)夜培養(yǎng)的單克隆在2ml的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5小時(shí)即可進(jìn)行小量質(zhì)粒提?。?/p>
4.適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，減少克隆DNA同源重組的發(fā)生，提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量；
5. 具有T1，T5噬菌體抗性。使用pUC19質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)109cfu/μg。
Mach1-T1菌株由野生型non-K-12 E.Coli W菌株改造而來(lái)，是目前生長(zhǎng)速度較快的感受態(tài)細(xì)胞之一，在平板上8h可見(jiàn)克隆，缺失核酸內(nèi)切酶(endA)，提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量；重組酶缺陷型(recA1398)減少插入片段的同源重組概率，保證了插入DNA的穩(wěn)定性；lacZΔM15的存在使Mach1-T1可用于藍(lán)、白斑篩選；tonA突變賦予Mach1-T1菌株對(duì)噬菌體T1和T5的抗性。Mach1-T1感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>109cfu/μg DNA。
操作方法
1.Mach1-T1感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA(質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。
2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無(wú)菌培養(yǎng)基(2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。
4.5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。
5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。如果進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，將平板放37℃培養(yǎng)至少13小時(shí)。
應(yīng)用[4][5]
用于從噬菌體十二肽庫(kù)中篩選人鈉泵α1亞基M1-M2膜外區(qū)特異性結(jié)合肽的研究
鈉泵α1亞基M1-M2膜外區(qū)蛋白的克隆和表達(dá)目的:利用基因重組技術(shù)構(gòu)建鈉泵α1亞基M1-M2膜外區(qū)蛋白的表達(dá)載體,通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)獲得蛋白,為隨機(jī)肽庫(kù)篩選實(shí)驗(yàn)提供靶分子。
方法:（1）鈉泵α1亞基M1-M2克隆載體的構(gòu)建。以質(zhì)粒YhNα1（含人鈉泵α1亞基cDNA序列）為模板,PCR擴(kuò)增得到α1亞基的2個(gè)基因片段:T1T2,T1T2D,其中T1T2含α1亞基N端至M2堿基序列,T1T2D含α1亞基N端至M1堿基序列。分別將其加尾后連接至克隆載體pGM-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選陽(yáng)性克隆,得到質(zhì)粒pGMT-T1T2,pGMT-T1T2D。測(cè)序驗(yàn)證基因序列是否與理論結(jié)果一致。
（2）鈉泵α1亞基M1-M2蛋白表達(dá)體系的構(gòu)建。分別從T載體質(zhì)粒上切下目的基因片段,雙酶切連接到表達(dá)載體pET32a（+）上并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta2,挑選陽(yáng)性克隆,得到質(zhì)粒pET32a（+）-T1T2,pET32a（+）-T1T2D。雙酶切驗(yàn)證目的基因序列是否正確。1%接種表達(dá)菌,用終濃度為0.4 mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:（1）以質(zhì)粒YhNα1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到基因片段T1T2,T1T2D,產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在相應(yīng)的位置出現(xiàn)明顯的條帶,說(shuō)明基因片段擴(kuò)增成功。將其加尾后連接至pGM-T載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α,挑選陽(yáng)性克隆擴(kuò)增并提取質(zhì)粒,雙酶切和測(cè)序結(jié)果顯示基因序列與理論一致。
（2）分別將目的基因片段與同樣雙酶切的pET32a（+）表達(dá)載體相連,轉(zhuǎn)化Rosetta2感受態(tài)細(xì)胞,在含Amp的平板上篩選重組子。雙酶切結(jié)果表明蛋白表達(dá)體系構(gòu)建成功。
參考文獻(xiàn)
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[2]Na+,K+-ATPase Isozyme Diversity;Comparative Biochemistry and Physiological Implications of Novel Functional Interactions[J].Ali Mobasheri,Julio Avila,Irene Cózar-Castellano,Michael D.Brownleader,Michael Trevan,Martin J.O.Francis,Joseph F.Lamb,Pablo Martín-Vasallo.Bioscience Reports.2000(2)
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[5]劉志文.從噬菌體十二肽庫(kù)中篩選人鈉泵α1亞基M1-M2膜外區(qū)特異性結(jié)合肽的研究[D].河北醫(yī)科大學(xué),2010.