背景及概述^[1]

三勝肽(GHK)是由甘氨酰、L-組氨酰與L-賴(lài)氨酸連接而成的一種天然三肽化合物(Gly-L-His-L-Lys)，其分子式為C14H24N6O4、分子量為340，三勝肽能與等當(dāng)量銅有效絡(luò)合而生成銅勝肽。銅是生物體內(nèi)重要元素，它參與細(xì)胞呼吸作用、生物體內(nèi)抗氧化、解毒、凝血、黑色素以及結(jié)締組織的生成等等重要的生理功能；三勝肽能通過(guò)有效絡(luò)合、轉(zhuǎn)運(yùn)銅元素而發(fā)揮相應(yīng)的作用，譬如絡(luò)合的銅勝肽能有效刺激成纖維細(xì)胞(fibroblasts)內(nèi)膠原蛋白的生物合成，從而促進(jìn)傷口的快速愈合；銅勝肽還能有效阻止乙醯膽堿物質(zhì)的神經(jīng)傳導(dǎo)，從而具有放松肌肉，改善動(dòng)態(tài)性皺紋等功效。三勝肽現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于化妝品添加劑。

制備^[1]

催化制備三勝肽(GHS，HKS，PPK，ADK組合)

以ATCC購(gòu)買(mǎi)的大腸桿菌(Escherichia coli K12)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae ATCC 204508)以及保氏桿菌(Paenarthrobacter aurescens TC1)染色體為模板用上述對(duì)應(yīng)引物PCR擴(kuò)增出ADK，gshB以及PPK基因片段，然后利用NEB公司購(gòu)買(mǎi)的Nde I/Xho I進(jìn)行相應(yīng)的酶切，并連接到相同切點(diǎn)的pET28a質(zhì)粒上(購(gòu)于Addgene)，最后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)入E coli Dh5a細(xì)胞，購(gòu)于擎科生物)并菌落PCR及基因測(cè)序驗(yàn)證。La1基因片段是通過(guò)公司合成(安徽通用生物)并亞克隆到pET28a質(zhì)粒上。最后以La1與gshB基因?yàn)槟０?，利用?突變引物(常規(guī)的PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn))構(gòu)建多位點(diǎn)突變酶基因GHS與HKS。將上述構(gòu)建到pET-28a載體上的GHS，HKS，PPK以及ADK質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)(購(gòu)于安徽通用生物)菌株里，在37℃、5ml含50uM卡那霉素(Kanamycin)的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行小量培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至OD0.5-0.8加入0.5mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)3小時(shí)，最后收集細(xì)胞、凍融法進(jìn)行細(xì)胞破碎、高速離心，收集到的上清液再利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確認(rèn)蛋白表達(dá)。蛋白表達(dá)正確的菌株逐級(jí)培養(yǎng)至5升發(fā)酵罐，在1.0mM IPTG條件下37℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，收集濕細(xì)胞近35-55克；最后將細(xì)胞與適量的Tris.HCl緩沖液(25mM，pH＝8.0)混合均勻后用高壓破碎儀低溫破碎，高速離心除去細(xì)胞壁后酶液保存在4℃冰箱備用。LB培養(yǎng)基構(gòu)成為：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氫二鉀、1％磷酸氫二鉀以及5％的甘油。

在1L 100mM pH 8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris.HCl)溶液中分別加入15克甘氨酸(200mM)，31克L-組氨酸(200mM)，29.2克L-賴(lài)氨酸(200mM)，5.6克三磷酸腺苷二鈉鹽ATP(10mM)，1.8克氯化鎂(20mM)，3.75克氯化鉀(20mM)以及51.6克多聚磷酸(Sigma，25聚，500mM單磷酸)，待pH值調(diào)節(jié)到8.0后；加入1000U的GHS酶液，1500U的HKS酶液，2000U的PPK以及1200U的ADK酶液。該反應(yīng)體系在室溫緩慢攪拌6小時(shí)(反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)添加HCl或NaOH水溶液維持體系pH值在6.5-9.0)后檢測(cè)原料大部分消耗(利用ProFoldin公司L-組氨酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)反應(yīng)液中殘留的組氨酸原料)。最后通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH終止反應(yīng)并沉底反應(yīng)液中的蛋白(加酸調(diào)節(jié)溶液pH值到1.5后并快速攪拌)，過(guò)濾除去蛋白沉淀，隨后將溶液調(diào)回pH值7.0；利用反滲透除鹽，D201陰離子交換樹(shù)酯除含磷酸雜質(zhì)(用去離子水做洗脫液，三勝肽GHK由于與樹(shù)脂結(jié)合能力弱直接流出)，凍干后甘氨酸-L-組氨酸-L-賴(lài)氨酸粗品通過(guò)純水和乙醇1:(1-3)v/v結(jié)晶得到59克灰白色固體(收率87％，純度96.0％)。

應(yīng)用^[2-3]

應(yīng)用一、

CN201910546288.5報(bào)道了一種含勝肽類(lèi)口腔保健牙膏及其制備方法，包含三勝肽和四勝肽，具體包括三勝肽、四勝肽、摩擦劑、保濕劑、表面活性劑、增稠劑和水。本發(fā)明利用三勝肽即藍(lán)銅勝肽具有抗氧化、抗炎、促進(jìn)膠原增生、協(xié)助傷口愈合的功能以及四勝肽為己酰四肽-3具有消腫抗水腫，改善微循環(huán)，加強(qiáng)血液循環(huán)，促進(jìn)潰瘍愈合的功效，可用于防治口腔潰瘍、咽喉腫痛、牙周炎、牙齦炎的同時(shí)能保持口腔清新衛(wèi)生。

應(yīng)用二、

CN201910296099.7報(bào)道了一種含牡丹抗氧化肽的牡丹香型面霜，按重量份含量計(jì)，包括以下組分：牡丹抗氧化肽13~17份、透明質(zhì)酸3~6份、膠原蛋白1~2份、六勝肽2~4份、三勝肽3~8份、牡丹花精油2~4份、牡丹花浸提液0.5~1份、三乙醇胺0.1~0.4份、十六醇1~4份、單硬脂酸甘油酯6~8份，防腐劑1~3份；牡丹抗氧化肽具有較強(qiáng)的抗氧化性，通過(guò)絡(luò)合銅離子，可以抑制酪氨酸酶的活性，防止黑色素的生成；三勝肽通過(guò)抑制酪氨酸酶的活性，能夠抑制黑色素的生成，兩者協(xié)同增效作用，使面霜具有較好的防曬功能；牡丹花精油和牡丹花浸提液含氨基酸和微量元素，能促進(jìn)細(xì)胞再生，防止衰老，使面霜具有牡丹花香味，本發(fā)明面霜質(zhì)地均勻、細(xì)膩，具有防曬、保濕、抗氧化、抗衰老的功效。

參考文獻(xiàn)

[1] [中國(guó)發(fā)明] CN202011231194.8 一種突變酶及其應(yīng)用和酶催化法制備三勝肽的工藝

[2] CN201910546288.5含勝肽類(lèi)口腔保健牙膏及其制備方法

[3] CN201910296099.7一種含牡丹抗氧化肽的牡丹香型面霜及其制備方法