背景^[1-3]

穩(wěn)定細胞株構(gòu)建適用于各種研究應(yīng)用，如重組蛋白和抗體生產(chǎn)、基因編輯、功能性研究等。

構(gòu)建穩(wěn)定細胞系的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標(biāo)志進行篩選。最常用的真核表達載體的抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418來代替新霉素進行選擇性篩選，篩選得到可穩(wěn)定表達目的蛋白，或者穩(wěn)定表達沉默特定基因的細胞株。

穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建周期長、難度大，每一步都很關(guān)鍵，尤其是細胞轉(zhuǎn)染，常用物理方法（電轉(zhuǎn)）、化學(xué)方法（脂質(zhì)體等）、生物方法（病毒），根據(jù)不同的實驗條件，選擇的方法，來達到實驗?zāi)康摹?/p>

目的蛋白的過表達往往是研究該基因/蛋白功能的常規(guī)手段，也是借助表達系統(tǒng)富集蛋白（DHFR、GS system）的方法。蛋白過表達穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建能很好的幫助研究這個蛋白，或者得到大量的目的蛋白。

主要包含如下步驟:

1.載體構(gòu)建（表達質(zhì)粒載體、病毒載體）；

2.轉(zhuǎn)染/感染；

3.目的蛋白初步檢測；

4.抗生素篩選；

5.目的蛋白再次檢測（定性/半定量）；

6.單克隆細胞株穩(wěn)定性檢測。

應(yīng)用^[4][5]

用于慢病毒法建立表達外源基因的人前列腺癌穩(wěn)定細胞株研究

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是真核細胞信號傳導(dǎo)的重要通路,其中p38作為該家族的亞族之一,參與了細胞內(nèi)如應(yīng)激反應(yīng)、增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程。在前列腺痛發(fā)生、發(fā)展的過程中,目前研究發(fā)現(xiàn)多種治療基因通過p38MAPK通路誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡。

因此設(shè)計將外源性的p38MAPK導(dǎo)入細胞內(nèi),并使細胞穩(wěn)定持續(xù)表達,觀察該基因過表達時對細胞生長增殖的影響,同時為未來通過該通路的治療靶點研究提供了工具。將外源基因轉(zhuǎn)入宿主細胞并使其表達的過程中,外源性目的基因的攜帶載體選擇成為最關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)。

目前基因治療中轉(zhuǎn)入基因的載體大體上可以分為兩大類：即病毒載體和非病毒載體。非病毒載體常用的方法包括電轉(zhuǎn)移法、磷酸鈣共沉淀法以及脂質(zhì)體法,可以達到瞬時表達的效果。但瞬時表達系統(tǒng)的外源基因表達會隨細胞生長繁殖而逐漸降低,且無法傳至子代細胞。病毒載體目前常用的包括腺病毒載體,腺相關(guān)病毒載體以及慢病毒載體。

其中慢病毒載體改造自逆轉(zhuǎn)錄病毒,具有以下特點：、慢病毒載體既能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細胞又能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細胞；第二、目的基因高效的整合于宿主細胞基因組內(nèi)實現(xiàn)長期而穩(wěn)定的表達并可以傳代給子代細胞；第三、不會引起宿主免疫反應(yīng)；第四,去除了原病毒復(fù)制的關(guān)鍵位點,提高了生物安全性。

對于前列腺癌的動物實驗中,如何監(jiān)測腫瘤細胞或者腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展的過程成為亟待解決的問題,目前常見的方法包括熒光蛋白法和生物發(fā)光法。熒光蛋白作為報告基因,在生物學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域,成為細胞內(nèi)分子影像的主流技術(shù)。

參考文獻

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