背景[1-3]
甲苯胺藍(Toluidine Blue O)是一種常用的人工合成染料,屬于醌亞胺染料類,這類染料主要含有胺基和醌型苯環(huán)兩個發(fā)色團，從而成色原顯色。甲苯胺藍中的陽離子有染色作用,組織細胞的酸性物質(zhì)與其中的陽離子相結(jié)合而被染色。甲苯胺藍還含有兩個助色團，能促使染料產(chǎn)生電離成鹽類,幫助發(fā)色團對組織產(chǎn)生染色力,使切片上的組織細胞著色，可染細胞核使之呈藍色。另外，肥大細胞胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組織胺等異色性物質(zhì)，遇到甲苯胺藍可呈異染性紫紅色，臨床上經(jīng)常用于肥大細胞染色。
甲苯胺藍染色液(細胞專用)適用于細胞內(nèi)酸性黏液多糖染色，尤其適用于含硫的酸性黏液物質(zhì)染色，染色后酸性黏多糖呈紅色。
操作步驟：
1、細胞涂片后，立即放入95%的乙醇中固定15s，取出放在紙巾上。
2、滴加甲苯胺藍染色液(細胞專用)進行滴染5min。
3、滴加等量蒸餾水于涂片上混勻，染色15min。
4、水洗、晾干、鏡檢。
染色結(jié)果：細胞內(nèi)酸性黏液多糖呈紅色。
注意事項：
為了證實染色效果，可選用慢性粒細胞白血病血片(嗜酸性粒細胞)或再生障礙性貧血骨髓涂片(組織嗜酸性粒細胞)作對照。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
應用[4][5]
用于Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對人軟骨細胞生物學特性的影響研究
通過觀察三種培養(yǎng)板中人軟骨細胞的生物學特性，了解Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對體外培養(yǎng)的人軟骨細胞的生物學特性的影響。
方法：軟骨組織標本來自于因股骨頸骨折行全髖置換術(shù)的患者。在實驗室經(jīng)過Ⅱ型膠原酶一步消化法處理關(guān)節(jié)軟骨后進行體外單層培養(yǎng)獲得大量軟骨細胞，經(jīng)過3個月軟骨細胞培養(yǎng)傳代至第7代，記為P0—P7，相差光鏡下觀察細胞形態(tài)，選擇第三代軟骨細胞進行研究。細胞計數(shù)后分別加入普通培養(yǎng)板（普通板），Ⅰ型膠原蛋白包被的培養(yǎng)板（Ⅰ型）、Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板（Ⅱ型）繼續(xù)培養(yǎng)。
通過評價細胞活性、倍增時間、相差光鏡觀察細胞形態(tài)來分析細胞培養(yǎng)結(jié)果，通過ELISA技術(shù)、甲苯胺藍染色來鑒定軟骨細胞表型，PCR技術(shù)、糖胺多糖定量檢測來了解軟骨細胞在三種培養(yǎng)板中分化增殖能力。
結(jié)果：(1)收集20例符合標準的關(guān)節(jié)軟骨標本，選擇培養(yǎng)后細胞形態(tài)正常、活性強的10組軟骨細胞進行試驗。
（2）從倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，剛消化好未貼壁軟骨細胞呈圓形，貼壁后細胞大小變化不大呈多角形。傳代后，細胞逐漸伸長，變大，隨著傳代數(shù)增加，細胞逐漸呈長梭形，類似成纖維細胞，前三代軟骨細胞具有明顯增殖活性，細胞形態(tài)相似，從第4代開始逐漸變?yōu)殚L梭形，到第7代，軟骨細胞完成變?yōu)槌衫w維細胞。
（3）將第3代軟骨細胞分別加入Ⅰ型、Ⅱ型和普通板后繼續(xù)培養(yǎng)7天后觀察，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型中軟骨細胞數(shù)量最多，且增殖速度為Ⅰ型的2倍，普通板的5倍，該結(jié)果提示其增殖速度較快。
檢測三種不同培養(yǎng)板中軟骨細胞分泌Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的量，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型中軟骨細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白最少，且與普通板檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而與Ⅰ型板檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義；Ⅱ型板中軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原蛋白量最多，與其他兩種培養(yǎng)板檢測結(jié)果的差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；甲苯胺藍染色及DMMB比色法定量檢測軟骨細胞分泌糖胺多糖的量，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型板上軟骨細胞分泌糖胺多糖最多，與Ⅰ型板、普通板檢測結(jié)果差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
參考文獻
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[5]蔣萍.Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對人軟骨細胞生物學特性的影響[D].川北醫(yī)學院,2012.