背景[1-3]
MDCK狗腎細(xì)胞是由S·H·Madin和N·B·Darby在1958年9月從一只外觀正常的成年雌性英國(guó)小獵犬的腎分離得到的；MDCK(NBL-2)細(xì)胞角蛋白免疫過氧化物酶染色呈陽(yáng)性；MDCK(NBL-2)細(xì)胞被用于研究β-粥樣蛋白前體的處理及其蛋白水解產(chǎn)物。
MDCK(NBL-2)（犬腎細(xì)胞）操作說明：
1)對(duì)于常溫運(yùn)輸?shù)募?xì)胞，收到細(xì)胞后，檢查是否有運(yùn)輸問題，即細(xì)胞培養(yǎng)瓶或管是否破損，細(xì)胞培養(yǎng)液是否溢出。若沒有運(yùn)輸問題，請(qǐng)75%酒精消毒后，保留封口膜，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置。嚴(yán)格檢查培養(yǎng)箱的參數(shù)：溫度，濕度和CO2濃度。細(xì)胞靜置時(shí)間一般為6-12小時(shí)后，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，即可開始后續(xù)操作。選用正確的細(xì)胞培養(yǎng)體系。
2)對(duì)于干冰運(yùn)輸?shù)募?xì)胞，請(qǐng)取出冷凍管后，須立即放入37C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。然后將其復(fù)蘇培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液。
應(yīng)用[4][5]
用于犬細(xì)小病毒YBYJ株全基因組克隆及其誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞凋亡的初步研究
首先根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的CPV序列設(shè)計(jì)7對(duì)引物,對(duì)CPV YBYJ株全基因組分段擴(kuò)增,克隆和測(cè)序,用DNAstar對(duì)測(cè)序結(jié)果拼接,其全基因組包含5 051個(gè)核苷酸。
與GeneBank中發(fā)表的其它犬細(xì)小病毒毒株進(jìn)行分子遺傳進(jìn)化學(xué)分析,結(jié)果表明,CPV YBYJ株與亞洲地區(qū)的毒株的親緣關(guān)系最近,YBYJ株與CPV,SICHUAN（MH476590）的同源性最高,為99%。與GeneBank中發(fā)表的其它細(xì)小病毒毒株進(jìn)行分子遺傳進(jìn)化學(xué)分析,結(jié)果表明,CPVYBYJ株與貓細(xì)小病毒（FPV）的親緣關(guān)系最近,基因組同源性是98.6%,與馬細(xì)小病毒（EqPV）的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),基因組同源性僅為35.1%。
本試驗(yàn)應(yīng)用CPV YBYJ強(qiáng)毒株在體外感染MDCK宿主細(xì)胞,通過光學(xué)顯微鏡和熒光倒置顯微鏡觀察到MDCK細(xì)胞被CPV感染后出現(xiàn)變圓、壞死和脫落等典型的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。隨著CPV感染時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞活性逐漸降低,具有一定的時(shí)間依賴性。
本試驗(yàn)成功建立CPV感染MDCK宿主細(xì)胞模型。通過細(xì)胞凋亡一DNA Ladder抽提試劑盒抽提CPV感染MDCK細(xì)胞的總DNA。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示明顯的DNA Ladder。熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察Annexin V-FITC/PI雙染法染色的樣品,CPV感染48 h時(shí),檢測(cè)孔內(nèi)有較多細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的蘋果綠色,部分細(xì)胞呈現(xiàn)綠色胞膜包裹著紅色的胞核。
分別提取CPV誘導(dǎo)12 h,24 h,36h,48h和60h時(shí)MDCK細(xì)胞的蛋白,使用酶標(biāo)儀確定Caspase-3相對(duì)活性,Caspase-3活性隨著時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低,并在48 h時(shí)達(dá)到峰值（p<0.01）。但隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),凋亡作用活性檢測(cè)指標(biāo)逐漸減弱。試驗(yàn)結(jié)果說明,CPV YBYJ強(qiáng)毒株在體外可以誘導(dǎo)MDCK宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡,誘導(dǎo)作用在感染48 h時(shí)最明顯,之后隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞趨于晚期凋亡并且壞死。
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