背景

糖尿病是一種常見的內分泌疾病，會導致許多危險的并發(fā)癥，包括糖尿病腎病(DN)。DN是世界范圍內終末期腎病(ESRD)的主要病因之一，其特點是以微量白蛋白尿為最早的臨床表現(xiàn)。DN早期主要是一種腎小球疾病，足細胞丟失多見于DN患者，DN中足細胞丟失與蛋白尿存在相關性。

足細胞是高度特化的終末分化的內臟上皮細胞，覆蓋在腎小球基底膜表面，構成腎小球濾過屏障，在維持腎小球選擇性濾過中發(fā)揮關鍵作用。越來越多的證據(jù)表明足細胞損傷是DN的主要危險因素之一，減輕足細胞損傷可以改善DN。但目前缺乏有效的治療藥物來減輕足細胞損傷。
高糖處理顯著降低了細胞存活率，增加了凋亡細胞的百分比。足細胞暴露于高糖會導致炎癥。

梓醇是一種天然環(huán)烯醚萜苷，是從長期用于中藥的地黃中提取的主要活性成分。據(jù)報道，梓醇具有廣泛的藥理活性，包括抗DN。先前的一些研究表明梓醇可以改善腎功能，減少蛋白尿，這與DN的足細胞損傷密切相關。然而，梓醇是否對DN的足細胞損傷有保護作用仍不清楚。梓醇的抗凋亡作用已經在幾個模型中得到證實。梓醇可通過抑制人單核細胞THP-1細胞的NADPH氧化酶活性來抑制AGE誘導的細胞內ROS的產生。

NOX4是一種與糖尿病相關的關鍵酶，已知在各種條件下會增加足細胞中的ROS水平。依賴NOX4的ROS產生誘導足細胞凋亡，這在DN條件下的足細胞損傷中觀察到。

活性氧(ROS)是正常代謝和異物暴露的產物，是DN發(fā)病的主要因素，對足細胞凋亡的啟動起著至關重要的作用。已經證實在DN的足細胞中ROS過度產生。
細胞凋亡是細胞死亡的一個嚴格控制的過程，是生物體發(fā)育和典型細胞生長所必需的，在體內和體外DN模型中都觀察到足細胞凋亡。Bax和Bcl-2是固有凋亡反應的關鍵介質，Bax刺激細胞凋亡，Bcl-2抑制細胞凋亡。通常用Bcl-2/Bax的比值來評價細胞凋亡的程度，當該比值降低時，表明細胞凋亡受到刺激。
受ROS調控的p38MAPK/NF-κB信號通路在細胞凋亡和炎癥中起重要作用。ROS下游的促凋亡信號因子p38MAPK的激活導致細胞凋亡。過量的ROS可以激活促凋亡的p38MAPK信號通路，這與DN的足細胞損傷和蛋白尿有關。NFκB是參與DN進展的重要轉錄因子，也是p38MAPK活化的重要下游轉錄因子。
TLR4/MyD88信號通路在體內和體外DN模型足細胞損傷的炎癥反應中起重要作用，TLR4基因敲除被證明可以減輕高糖誘導的足細胞損傷中細胞凋亡的增加。TLR4可以招募MyD88，在足細胞損傷中還可以激活NF-κB信號通路和細胞因子的產生。

目的

本研究采用高糖誘導的足細胞損傷模型，探討梓醇對高糖誘導的足細胞損傷的保護作用及其機制。

方法

細胞培養(yǎng)

MTT  檢測細胞活力

乳酸脫氫酶評估  檢測細胞活力

流式細胞儀檢測

二氯熒光素法  檢測ROS（氧化應激）

Annexin V/PI染色  檢測凋亡

SOD和MDA  測定氧化應激

ELISA  檢測足細胞炎癥細胞因子水平

免疫熒光染色  檢測凋亡

免疫印跡  檢測蛋白表達  

結果及討論

梓醇能逆轉高糖誘導的足細胞損傷。研究中，高糖降低足細胞Bcl-2/Bax的比值，導致足細胞凋亡，梓醇升高足細胞Bcl-2/Bax的比值，表明梓醇對凋亡有很大的阻斷作用。高糖可促進促炎細胞因子IL-1β、T N F-α和IL-6的分泌，梓醇可逆轉這一作用。研究中，高糖增加了NOX4的表達和細胞內ROS水平，梓醇可緩解NOX4和ROS的升高。這些結果為梓醇拮抗高糖誘導的ROS生成提供了證據(jù)，表明梓醇對高糖誘導的足細胞損傷的抗凋亡和抗炎作用與其抗氧化作用有關。
研究中，雖然對照組和高糖處理的足細胞中p38MAPK的表達沒有差異，但高糖處理的足細胞中p38MAPK的磷酸化明顯高于對照組處理的足細胞，這種磷酸化被梓醇逆轉。該研究中，高糖處理的足細胞的p-I Bα和NF-κB的核轉位明顯高于對照組處理的足細胞，而梓醇可抑制這兩種作用。這些結果表明梓醇可以抑制高糖誘導的足細胞損傷中的p38MAPK/NF-κB信號通路，這與梓醇的抗凋亡和抗炎作用有關。

研究中，TLR4/MyD88信號通路被激活，在高糖誘導的足細胞損傷中觀察到細胞因子的產生，這與一些研究的結果一致。梓醇可顯著下調TLR4和MYD88的表達，從而阻止I-κBα磷酸化和降解，可能抑制NF-κB移位到細胞核內，從而抑制炎癥反應的激活。

總結

本研究證實梓醇對高糖誘導的足細胞損傷具有抗凋亡和抗炎作用。這些作用可能與抑制NOX4,減輕活性氧生成，抑制TLR4/MyD88和p38MAPK信號通路，阻止NF-κB活化和移位有關。因此梓醇有望成為治療糖尿病腎病足細胞損傷的有效藥物。

研究思路 

MTT試驗和LDH釋放實驗發(fā)現(xiàn)細胞活力顯著提，即梓醇對高糖誘導的足細胞有保護作用。在為確定梓醇對高糖條件下足細胞抗氧化酶活性的影響，我們測定了SOD活性和MDA水平。此外，我們接下來評估了用DCFH-DA染色的足細胞中ROS的產生發(fā)現(xiàn)梓醇可抑制高糖誘導的足細胞ROS生成。為了評估高糖對ROS生成酶表達的可能影響，我們分析了已知在不同條件下增加足細胞ROS水平的與糖尿病相關的關鍵酶NOX4的表達。為了闡明梓醇的保護作用是否與減少凋亡有關，采用流式細胞儀檢測足細胞凋亡。高糖誘導的足細胞損傷總是與炎癥相關。為探討梓醇的抗炎作用，我們用ELISA法檢測了高糖處理組大鼠足細胞IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。TLR4/MyD88信號通路在足細胞損傷中起重要作用。由于ROS可以通過p38MAPK/NF-κB信號通路誘導細胞凋亡，我們分析了p38MAPK和IκBα的表達及其磷酸化。此外，該研究還做了免疫熒光染色研究發(fā)現(xiàn)高糖顯著增加NFκB向細胞核的易位而梓醇逆轉了這一作用。

References:

Chen, Y., et al., The protective effect and mechanism of catalpol on high glucose-induced podocyte injury. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2019. 19(1).