背景[1-3]
C57BL6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基添加了能有效改善細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的營養(yǎng)物質(zhì)和特別甄選的優(yōu)質(zhì)胎牛血清，適合C57BL/6小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，由于骨髓是其主要來源，因此統(tǒng)稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
間充質(zhì)干細(xì)胞最初是由Friedenstein等人于1987年發(fā)現(xiàn)的一類成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，易于貼附于塑料培養(yǎng)板表面，目前發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱、神經(jīng)等組織分化的潛能。在機(jī)體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞存在于骨髓、胎盤、臍帶、羊膜、脂肪等組織中，尤以骨髓中數(shù)量較多、分化能力最強(qiáng)。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞分化的能力，這些細(xì)胞包括成肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、造血干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等，在兩性霉素B和5-氮胞苷作用下，還可形成肌小點(diǎn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織損傷及退行性病變的治療前景巨大。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單獨(dú)應(yīng)用可以較好地促進(jìn)骨折愈合和軟骨損傷的修復(fù)，通過體外培養(yǎng)使其覆蓋于陶瓷支架或碳纖維網(wǎng)絡(luò)等再植入患處效果更明顯。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)，因具有黏附于塑料培養(yǎng)皿壁的能力而易于分享，體外經(jīng)過長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)和冷凍保存后不會(huì)改變其分化潛能，植入以后可以分化成造血以外的組織，如肺、軟骨、骨、神經(jīng)等，并表現(xiàn)出相應(yīng)組織細(xì)胞的表型。
應(yīng)用[4][5]
用于L型鈣離子通道阻滯劑貝尼地平對(duì)C57/BL6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的體內(nèi)外研究
骨間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSC)大量存在于骨髓腔中,是成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的前體細(xì)胞,并具有分化成神經(jīng)細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞等的潛力。作為研究骨代謝的良好工具細(xì)胞,對(duì)BMSC成骨分化的干預(yù)能明顯影響機(jī)體的成骨能力,作為成骨細(xì)胞的祖細(xì)胞,BMSC上發(fā)現(xiàn)的成骨證據(jù)可對(duì)成骨細(xì)胞的生理作用產(chǎn)生較大影響。
目前,隨著對(duì)骨代謝研究的深入,藥物干預(yù)可作為長(zhǎng)期手段影響B(tài)MSC的成骨分化,為臨床上干預(yù)骨質(zhì)疏松提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。貝尼地平作為臨床上常用的降血壓藥物,其主要機(jī)制是通過調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞上的L型鈣離子通道的開閉,進(jìn)而調(diào)控平滑肌的收縮舒張,最終調(diào)控全身血壓。作為抗高血壓的常用藥物,貝尼地平具有持續(xù)干預(yù)的潛力。
此外,目前貝尼地平對(duì)骨代謝的在體作用仍不明了,因此,本實(shí)驗(yàn)通過觀察貝尼地平對(duì)BMSC的成骨分化影響,以及貝尼地平灌胃去卵巢C57/BL骨質(zhì)疏松模型小鼠來探討鈣離子通道阻滯劑對(duì)骨代謝的作用及機(jī)制。
取原代BMSCs所用的雌性4周大C57/BL6小鼠,體重10-15g,購至內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：(1)主要儀器：倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon,TE2000-U),(2)主要試劑：一抗Runx2(CST公司),一抗OCN(CST公司),一抗GAPDH(CST公司),一抗β-catenin(CST公司),一抗LRP5(CST公司),ALP染色試劑盒(碧云天生物試劑公司),Caspase-8比色測(cè)定工具包(凱基生物公司),貝尼地平(Sigma公司),α-MEM(Hyclone公司),胎牛血清(Gibco公司)。
BMSCs的提取與培養(yǎng)小鼠寰樞椎脫臼處死后75%酒精浸泡消毒5分鐘,在超凈臺(tái)中用眼科剪和眼科鑷剝開小鼠皮膚,從髖臼關(guān)節(jié)處取下小鼠雙下肢,PBS清洗掉粘連毛發(fā),剝離附屬肌肉等軟組織整理出股骨,浸泡于α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,用一套新的滅菌眼科剪和眼科鑷剪開股骨雙側(cè)骨端暴露骨髓腔,用1 ML注射器吸取10%FBS的完全培養(yǎng)基沖出骨髓,反復(fù)并兩端交換沖洗,待骨頭發(fā)白后將含有骨髓的完全培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至干凈的15 ML離心管,800 r/min低速離心5分鐘,骨髓重懸后轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中5%的CO2下37℃培養(yǎng),培養(yǎng)基3天更換1次。
參考文獻(xiàn)
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