背景[1-3]
Anti-ACTA2 Rabbit Monoclonal Antibody是一類可以特異性結(jié)合Anti-ACTA2的單克隆抗體，主要用于檢測Anti-ACTA2的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。
檢測原理：雙抗體夾心法測定標(biāo)本中Anti-ACTA2水平。用純化的Anti-ACTA2抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Anti-ACTA2，再與HRP標(biāo)記的Anti-ACTA2抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Anti-ACTA2呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中Anti-ACTA2濃度。
ACTA2（actin alpha 2）是一種肌動蛋白，有多個(gè)別名，包括α-肌動蛋白、α-肌動蛋白-2、主動脈平滑肌或α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)。Actins是球狀多功能蛋白質(zhì)的一個(gè)家族，形成微絲。ACTA2是6種不同肌動蛋白亞型之一，參與平滑肌的收縮。ACTA2（和所有actins一樣）極其保守，幾乎在所有哺乳動物中都有發(fā)現(xiàn)。在人類中，ACTA2由位于10q22-q24的ACTA2基因編碼。該基因突變導(dǎo)致多種血管疾病，如胸主動脈疾病、冠狀動脈疾病、中風(fēng)、煙霧病和多系統(tǒng)平滑肌功能障礙綜合征。ACTA2（α-SMA）目前被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志。
應(yīng)用[4][5]
用于MMP1通路軸對乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究
調(diào)控MMP1分泌的相關(guān)分子以及調(diào)控方式,為乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)研究提供靶點(diǎn)。
方法：(1)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231與V2M4細(xì)胞總蛋白與MMP1特異性抗體做免疫共沉淀,尋找與MMP1直接作用的蛋白；質(zhì)譜分析所有免疫共沉淀蛋白并行western驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其中高低轉(zhuǎn)移株的差異蛋白(ACTA2);
(2)以實(shí)時(shí)定量PCR檢測相關(guān)蛋白mRNA水平變化；
(3) 以激光共聚焦證明細(xì)胞內(nèi)MMP1與ACTA2蛋白確實(shí)存在結(jié)合；
(4) 以蛋白表達(dá)證明及Pull down實(shí)驗(yàn)表明蛋白相互作用的直接性；
(5) 構(gòu)建ACTA2基因沉默質(zhì)粒并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染V2M4,進(jìn)一步做western及實(shí)時(shí)定量PCR檢測MMP1的表達(dá)；進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及增殖實(shí)驗(yàn),三維凝膠實(shí)驗(yàn)；免疫缺陷鼠乳房墊注射后觀察體內(nèi)成瘤及腫瘤肺轉(zhuǎn)移情況；
(6) ACTA2病毒過表達(dá)載體構(gòu)建,MDA-MB-435及MDA-MB-231轉(zhuǎn)染,流式細(xì)胞儀篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并行ACTA2基因沉默質(zhì)粒構(gòu)建并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染V2M4進(jìn)一步做western及實(shí)時(shí)PCR檢測MMP1表達(dá)情況,行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及增殖實(shí)驗(yàn),三維凝膠實(shí)驗(yàn)；
(7) 利用含鈣及無鈣DMEM培養(yǎng)基檢測鈣對MMP1分泌的影響；
(8) 構(gòu)建肌動蛋白特異性載體(pro-50)檢測ACTA2聚合與解聚對MMP1分泌的影響；篩選鈣特異性配體門控通道,得到TRPV6表達(dá)差異；
(9)構(gòu)建TRPV6基因沉默載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Vb行體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明鈣通道對MMP1分泌的影響；以TRPV6的興奮劑與抑制劑進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
參考文獻(xiàn)
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[3]Increased expressions of cannabinoid receptor-1 and transient receptor potential vanilloid-1 in human prostate carcinoma[J].Gabriella Czifra,Attila Varga,Katalin Nyeste,Rita Marincsák,Balázs I.Tóth,Ilona Kovács,LászlóKovács,Tamás Bíró.Journal of Cancer Research and Clinical Oncology.2009(4)
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[5]石鵬程.MMP1通路軸對乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究[D].復(fù)旦大學(xué),2010.