背景[1-3]
Anti-AKT1抗體是一類可以特異性結(jié)合Anti-AKT1的多克隆抗體，主要用于檢測Anti-AKT1的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。
檢測原理：雙抗體夾心法測定標(biāo)本中Anti-AKT1水平。用純化的Anti-AKT1抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Anti-AKT1，再與HRP標(biāo)記的Anti-AKT1抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Anti-AKT1呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中Anti-AKT1濃度。
AKT/蛋白激酶B信號(hào)作用通道調(diào)控細(xì)胞增殖和生長，參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過程。雖然在其他通道構(gòu)成部分中也發(fā)現(xiàn)了激發(fā)突變的現(xiàn)象，而以前卻不知道有激發(fā)癌癥的AKT點(diǎn)突變。
AKT1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）依賴的機(jī)制被胞外信號(hào)激活，目前發(fā)現(xiàn)AKT家族有三個(gè)成員，分別為AKT1/PKBα、AKT2/PKBβ和AKT3/PKBγ。
AKT則是PI3K/AKT信號(hào)通路中核心因子，PI3Ks能特異性磷酸化磷脂酰肌醇（PI）的3位羥基，產(chǎn)生第二信使肌醇類物質(zhì)如PIP3，PIP3可促使AKT轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上并被PDK1/PDK2活化，活化的AKT重新定位到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或細(xì)胞內(nèi)其它部位，磷酸化大量的底物蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，異?；罨腁KT會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
應(yīng)用[4][5]
用于雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-185與AKT1靶標(biāo)關(guān)系研究
在A549,NCI-H1975,NCI-H1650和LTEP-a-2四種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中mi R-185表達(dá)明顯下調(diào),絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(Serine/threonine Protein Kinase 1,AKT1)表達(dá)明顯升高,二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示mi R-185對(duì)AKT1具有調(diào)控作用,AKT1可能是mi R-185的潛在靶基因,但不能確定二者直接相關(guān)。
為了研究mi R-185與AKT1之間靶標(biāo)關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建克隆有目的基因片段的雙熒光素酶報(bào)告基因載體,利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)驗(yàn)證二者相互關(guān)系。為后續(xù)進(jìn)一步探討mi R-185和AKT1基因在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
方法：利用生物信息學(xué)軟件,預(yù)測mi R-185調(diào)控AKT1基因結(jié)合序列,設(shè)計(jì)合成AKT13’-UTR序列及突變后AKT13’-UTR序列,將合成的兩種目的基因片段,分別克隆到pmir GLO雙熒光素酶報(bào)告基因載體,構(gòu)建AKT13’-UTR雙熒光素酶報(bào)告基因野生型載體(pmir GLO-AKT1)及其突變型載體(pmir GLO-mut-AKT1)。重組載體經(jīng)PCR電泳和基因測序鑒定,以證明重組載體構(gòu)建成功。
使用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine TM 2000分別將這兩種重組載體質(zhì)粒與mi R-185模擬物(mimics)或mi R-185陰性對(duì)照(Negative Control,NC)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,并利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測其活性。雙熒光素酶報(bào)告基因載體中含有能在同一細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)的兩種熒光素酶基因,一個(gè)是螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因,另一個(gè)是海腎熒光素酶報(bào)告基因。
螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因?yàn)橹饕獔?bào)告基因,目的基因片段被克隆至螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因下游的多克隆位點(diǎn)上(Mμltiple cloning site,MCS)。若目的基因表達(dá)被抑制,則使螢火蟲熒光素酶轉(zhuǎn)錄過程受阻,抑制螢火蟲熒光素酶蛋白翻譯,螢火蟲熒光值下降,而作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參照的海腎熒光素酶的表達(dá)不受影響,此時(shí)螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性值下降,從而可以確定mi RNA與靶基因是否具有直接調(diào)控作用。
參考文獻(xiàn)
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