背景[1-3]
Anti-AKT1抗體是一類可以特異性結(jié)合Anti-AKT1的多克隆抗體，主要用于檢測Anti-AKT1的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實驗。
檢測原理：雙抗體夾心法測定標(biāo)本中Anti-AKT1水平。用純化的Anti-AKT1抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Anti-AKT1，再與HRP標(biāo)記的Anti-AKT1抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Anti-AKT1呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中Anti-AKT1濃度。
AKT/蛋白激酶B信號作用通道調(diào)控細胞增殖和生長，參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細胞過程。雖然在其他通道構(gòu)成部分中也發(fā)現(xiàn)了激發(fā)突變的現(xiàn)象，而以前卻不知道有激發(fā)癌癥的AKT點突變。
AKT1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）依賴的機制被胞外信號激活，目前發(fā)現(xiàn)AKT家族有三個成員，分別為AKT1/PKBα、AKT2/PKBβ和AKT3/PKBγ。
AKT則是PI3K/AKT信號通路中核心因子，PI3Ks能特異性磷酸化磷脂酰肌醇（PI）的3位羥基，產(chǎn)生第二信使肌醇類物質(zhì)如PIP3，PIP3可促使AKT轉(zhuǎn)移到細胞膜上并被PDK1/PDK2活化，活化的AKT重新定位到細胞質(zhì)、細胞核或細胞內(nèi)其它部位，磷酸化大量的底物蛋白，進而調(diào)節(jié)細胞的功能，異?；罨腁KT會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
應(yīng)用[4][5]
用于雙熒光素酶報告基因檢測miR-185與AKT1靶標(biāo)關(guān)系研究
在A549,NCI-H1975,NCI-H1650和LTEP-a-2四種非小細胞肺癌細胞株中mi R-185表達明顯下調(diào),絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(Serine/threonine Protein Kinase 1,AKT1)表達明顯升高,二者表達呈負相關(guān)關(guān)系,提示mi R-185對AKT1具有調(diào)控作用,AKT1可能是mi R-185的潛在靶基因,但不能確定二者直接相關(guān)。
為了研究mi R-185與AKT1之間靶標(biāo)關(guān)系,本實驗構(gòu)建克隆有目的基因片段的雙熒光素酶報告基因載體,利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證二者相互關(guān)系。為后續(xù)進一步探討mi R-185和AKT1基因在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能機制提供實驗基礎(chǔ)。
方法：利用生物信息學(xué)軟件,預(yù)測mi R-185調(diào)控AKT1基因結(jié)合序列,設(shè)計合成AKT13’-UTR序列及突變后AKT13’-UTR序列,將合成的兩種目的基因片段,分別克隆到pmir GLO雙熒光素酶報告基因載體,構(gòu)建AKT13’-UTR雙熒光素酶報告基因野生型載體(pmir GLO-AKT1)及其突變型載體(pmir GLO-mut-AKT1)。重組載體經(jīng)PCR電泳和基因測序鑒定,以證明重組載體構(gòu)建成功。
使用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine TM 2000分別將這兩種重組載體質(zhì)粒與mi R-185模擬物(mimics)或mi R-185陰性對照(Negative Control,NC)共轉(zhuǎn)染293T細胞,并利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測其活性。雙熒光素酶報告基因載體中含有能在同一細胞中同時表達的兩種熒光素酶基因,一個是螢火蟲熒光素酶報告基因,另一個是海腎熒光素酶報告基因。
螢火蟲熒光素酶報告基因為主要報告基因,目的基因片段被克隆至螢火蟲熒光素酶報告基因下游的多克隆位點上(Mμltiple cloning site,MCS)。若目的基因表達被抑制,則使螢火蟲熒光素酶轉(zhuǎn)錄過程受阻,抑制螢火蟲熒光素酶蛋白翻譯,螢火蟲熒光值下降,而作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參照的海腎熒光素酶的表達不受影響,此時螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性值下降,從而可以確定mi RNA與靶基因是否具有直接調(diào)控作用。
參考文獻
[1]Effect of microRNA-21 on multidrug resistance reversal in A549/DDP humanlung cancer cells[J].Zuoliang Dong,Li Ren,Li Lin,Jiang Li,Yiwen Huang,Jinhong Li.Molecular Medicine Reports.2015(1)
[2]Suppression of AKT expression by mi R‐153 produced anti‐tumor activity in lung cancer[J].Ye Yuan,Weijie Du,Ying Wang,Chaoqian Xu,Jinghao Wang,Yang Zhang,Huimin Wang,Jiaming Ju,Liang Zhao,Zhiguo Wang,Yanjie Lu,Benzhi Cai,Zhenwei Pan.Int.J.Cancer.2015(6)
[3]Ezrin protein overexpression predicts the poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinomas[J].Junjie Piao,Shusen Liu,Yunjie Xu,Changan Wang,Zhenhua Lin,Yunzhi Qin,Shuangping Liu.Experimental and Molecular Pathology.2015(1)
[4]Role of microRNA-34 family in cancer with particular reference to cancer angiogenesis[J].Hamidreza Maroof,Ali Salajegheh,Robert Anthony Smith,Alfred King-Yin Lam.Experimental and Molecular Pathology.2014(2)
[5]曹大龍.雙熒光素酶報告基因檢測miR-185與AKT1靶標(biāo)關(guān)系[D].蚌埠醫(yī)學(xué)院,2015.