背景[1-3]
脂肪酰輔酶A還原酶2抗體是可以特異性結(jié)合脂肪酰輔酶A還原酶21的一類多克隆抗體，主要用于檢測(cè)脂肪酰輔酶A還原酶2的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。
檢測(cè)原理：雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中脂肪酰輔酶A還原酶2水平。用純化的脂肪酰輔酶A還原酶2抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入脂肪酰輔酶A還原酶2，再與HRP標(biāo)記的脂肪酰輔酶A還原酶2抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的脂肪酰輔酶A還原酶2呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中脂肪酰輔酶A還原酶2濃度。
脂肪?；o酶A還原酶2屬于脂肪酰基輔酶A還原酶家族。主要表達(dá)在眼瞼的瞼板腺和皮膚的皮脂腺。大腦中也有表達(dá)并合成了大量的醚脂。其生物學(xué)功能包括脂質(zhì)代謝過程，長(zhǎng)鏈脂肪酰基輔酶A代謝過程以及蠟酯生物合成過程等。脂肪酰基輔酶A還原酶2參與蠟酯生物合成的步的還原酶蛋白編碼，利用C16或C18飽和脂肪酸作為底物，將脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪醇。
應(yīng)用[4][5]
用于白蠟蟲脂酰輔酶A還原酶基因（EpFAR）的克隆表達(dá)與功能研究
白蠟蟲（Ericerus pela Chavanness）是我國(guó)特有的一種資源昆蟲,由于它能分泌性質(zhì)優(yōu)異的蟲白蠟,在中國(guó)已經(jīng)被人工養(yǎng)殖上千年,蟲蠟主要用于蠟染、蠟燭、刻板模印、中藥等行業(yè)。
蟲白蠟是以高級(jí)飽和一元酸和高級(jí)飽和一元醇所構(gòu)成的酯類為主要成分。?；€原途徑是生物體內(nèi)蠟酯合成的主要途徑之一,即脂酰輔酶A（fatty acyl-CoA）在脂酰輔酶A還原酶（fatty acyl-CoAreductase,FAR）的作用下還原生成脂肪醇,脂肪醇和脂酰輔酶A在蠟酯合酶（wax synthase,WS）的作用下生成酯。前期研究表明白蠟蟲fatty acyl-CoA reductase（EpFAR）基因是與泌蠟密切相關(guān)的基因之一。
采用分子生物學(xué)的相關(guān)技術(shù)方法,首先克隆獲得白蠟蟲EpFAR基因,明確了白蠟蟲EpFAR基因的序列特征,分析該基因在蟲體內(nèi)各組織的轉(zhuǎn)錄水平和編碼蛋白的表達(dá)譜,進(jìn)一步在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)EpFAR蛋白,通過檢測(cè)EpFAR酶的生物反應(yīng)產(chǎn)物明確基因EpFAR的功能。
獲得的主要結(jié)果如下:1白蠟蟲EpFAR序列特征與系統(tǒng)發(fā)育本文在課題組前期研究得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)上,選擇其中的脂酰輔酶A還原酶基因序列片段,采用RACE擴(kuò)增技術(shù),克隆得到了EpFAR基因的3’端和5’端序列,經(jīng)DNAMAN軟件拼接后,上傳至NCBI在線比對(duì),與其他生物的脂肪酰輔酶A還原酶基因同源,證明所得的基因?yàn)榘紫炏x的脂肪酰輔酶A還原酶基因,獲得了該基因全長(zhǎng)cDNA,命名為EpFAR。
基因EpFAR開放閱讀框長(zhǎng)1569 bp,共編碼522個(gè)氨基酸,分子量為60.3kDa,該基因具有典型的FAR基因的特征,屬于SDR superfamily成員,屬于NADBRossmann superfamily成員,FARC superfamily成員。
在其氮端具有特異的FAR-NSDRe結(jié)構(gòu)域（22-353aa）,NADbinding4結(jié)構(gòu)（26-297 aa）,以及Extended SDRs所有的典型的輔因子結(jié)合基序TGXXGXXG（24-34aa）,Classical SDRs所具有的活性位點(diǎn)基序YXXXK（216-220aa）,在其碳端具有特異的FARC結(jié)構(gòu)域（387-477）,Sterile結(jié)構(gòu)（388-479aa）。
該基因所具有的保守結(jié)構(gòu)域表明該基因序列較為復(fù)雜,可能參與復(fù)雜的代謝途徑,發(fā)揮不同的分子功能。
參考文獻(xiàn)
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