背景及概述^[1][2]

雷帕霉素(Rapamycin)現(xiàn)稱為西羅莫司(Sirolimus)，是1975年由Veniza等分離得到的吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)所產(chǎn)的大環(huán)內(nèi)脂類抗生素。經(jīng)過多年的研究雷帕霉素現(xiàn)已被開發(fā)成為臨床使用的強效免疫抑制劑。同時以雷帕霉素為前體，化學(xué)修飾合成所得的一些結(jié)構(gòu)新穎衍生物，被發(fā)現(xiàn)在免疫抑制、抗癌、抗帕金森氏癥與艾滋病等方面上，具有新的治療作用，其中其合成物Temsirolimus、Everolimus、AP23573已作為抗腫瘤靶向新藥物進(jìn)行臨床研究，雷帕霉素在醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域具有廣泛前景。

雷帕霉素

制備^[2]

當(dāng)前雷帕霉素的生產(chǎn)主要通過發(fā)酵法生產(chǎn)，如中國發(fā)明專利申請公布書CN101486976A所述一般西羅莫司發(fā)酵效價只有200μg/ml左右，發(fā)酵副產(chǎn)物較多，導(dǎo)致后序提取時的層析分離比較困難，工作較為復(fù)雜，酵培養(yǎng)的發(fā)酵液經(jīng)過濾得菌體后經(jīng)甲醇萃取濃縮后，再通過一系列純化工藝如色譜層析、萃取、結(jié)晶等獲得西羅莫司純品，產(chǎn)品收率低于20％。所以該說明書公開了一種吸水鏈霉菌及其應(yīng)用的技術(shù)方案，提供了一種高單位的西羅莫司產(chǎn)生菌，效價為600μg/ml以上，但是產(chǎn)品收率只達(dá)到了30～35％。

CN102443012A公布了一種高純度提取純化方法a.用丙酮或乙醇抽提發(fā)酵液過濾后得到的菌絲體，得到抽提液后，真空濃縮得濃縮抽提液；b.用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液過濾后得到的上清液，分離乙酸乙酯相得萃取液，真空濃縮得濃縮萃取液；c.將a中的濃縮抽提液和b中的濃縮萃取液合并得濃縮液，并加入到裝有大孔樹脂的床層進(jìn)行吸附，用丙酮和水的混合溶液作為洗滌劑洗滌大孔樹脂，收集洗脫液并真空濃縮，得濃縮洗脫液；d.用乙酸乙酯萃取c得到的濃縮洗脫液，經(jīng)無水硫酸鈉或無水硫酸鎂脫水后真空濃縮得濃縮液，上樣硅膠柱進(jìn)行層析分離，正庚烷和丙酮混合溶液作為洗滌劑洗滌硅膠柱，正庚烷和丙酮混合溶液作為洗脫劑洗脫硅膠柱，收集洗脫液并真空濃縮得濃縮液；e.將步驟d得到的濃縮液溶于石油醚或乙醚中結(jié)晶，干燥得到雷帕霉素粗品。f.丙酮溶解雷帕霉素粗品，真空濃縮后用乙醚重結(jié)晶，干燥得到雷帕霉素純品。

楊國新等在《海峽藥學(xué)》(2007年，第19卷第17期，25-26頁)文獻(xiàn)中公開：發(fā)酵液經(jīng)離心后得到菌絲體，菌絲體用兩倍量體積的95％酒精分別浸泡兩次，離心棄菌絲渣，合并酒精浸泡液，減壓濃縮去除酒精。殘留液用等體積的乙酸乙酯分別萃取兩次，合并乙酯層并用飽和NaCl溶液洗滌1次，經(jīng)無水Na2SO4干燥1h后，過濾，減壓濃縮除去乙酸乙酯得上柱物。上柱物溶于適當(dāng)體積的洗脫劑(乙酯-石油醚洗脫系統(tǒng))，200～300目硅膠柱層析，分段收集，HPLC檢測，合并含西羅莫司的洗脫液，減壓濃縮，濃縮液經(jīng)乙醚結(jié)晶，洗晶，結(jié)晶。經(jīng)上述制備的西羅莫司結(jié)晶溶于少量的洗脫劑，硅膠(200～300目)柱層析分離，分部收集，分離過程用高效液相跟蹤檢測。合并含西羅莫司的洗脫液，減壓濃縮，濃縮液經(jīng)乙醚結(jié)晶，洗晶，重結(jié)晶得高純度西羅莫司樣品。

美國專利公布說明書US20100029933A1公布了雷帕霉素的純化技術(shù)方案，該方案從發(fā)酵液中純化得到純品純度達(dá)到98.8％，總雜質(zhì)含量小于1.2％，單雜低于0.15％，提純方案為a)用疏水性溶劑萃取發(fā)酵液中的雷帕霉素并濃縮b)加入親水性的溶劑分離雜質(zhì)；c)將步驟得到的產(chǎn)物吸附到惰性載體上，用堿和酸連續(xù)洗滌，然后洗脫；d)收集步驟c得到的洗脫液或直接用步驟b中含雷帕霉素的溶液，上硅膠柱，收集洗脫液；e)將步驟d)得到的產(chǎn)物結(jié)晶；f)溶解f步驟中的結(jié)晶品，進(jìn)行疏水作用或反相色譜；并將g重結(jié)晶得到的高哦純度的雷帕霉素但是利用該方法純化收率不高，在一個具體實例中可以得知11kg的雷帕霉素發(fā)酵液最后的純品只有6g，稱取3g純品進(jìn)一步純化結(jié)晶得到2.5g。

朱健等在中國醫(yī)藥工業(yè)雜志發(fā)表的文章《他克莫司產(chǎn)生菌的選育和生產(chǎn)工藝研究》中公開了采用發(fā)酵液板框所得菌體丙酮浸泡，抽提液濃縮或加水稀釋使丙酮濃度<50％(V/V)，用大孔吸附樹脂吸附，低濃度的丙酮解析，再以高濃度丙酮解析。濃縮脫除丙酮，雷帕霉素不溶于水而形成沉淀，沉淀用乙醇溶解后結(jié)晶。初次結(jié)晶得到的純度約為90％，乙醇重結(jié)晶1～2次后，純度可提高至95％。

藤澤藥業(yè)工業(yè)公司(徐親民.他克莫司的工業(yè)化研究[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊,2000,21(4):151-155)報道采用主要工藝為收集菌絲體，丙酮浸泡，濃縮，經(jīng)過Diaion HP20樹脂處理，洗脫液濃縮后乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮后經(jīng)過酸性硅膠柱層析，再次經(jīng)普通硅膠層析，最后通過乙腈重結(jié)晶得到產(chǎn)品。

主要參考資料

[1] 郝俊, 曹國番, 楊潔, 楊懿銘, 李振華, & 楊燕等. (2012). 雷帕霉素對人cd4+cd25+調(diào)節(jié)性t細(xì)胞體外擴增的影響. 現(xiàn)代免疫學(xué), 032(005), 404-411.

[2] 楊震坤, 沈衛(wèi)峰, 張瑞巖, 張建盛, 胡健, & 張奇等. (2006). 雷帕霉素洗脫支架治療冠狀動脈慢性完全性閉塞病變. 中國循環(huán)雜志, 021(002), 110-112.

[3] 陸莉, & 林志彬. (2001). 一種新型的免疫抑制劑--雷帕霉素. 中國藥學(xué)雜志, 036(009), 643-645.