背景[1-3]
人芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA KIT用純化的人芳基硫酸酯酶A(ASA)抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗該指標(biāo)抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗人芳基硫酸酯酶A(ASA)指標(biāo)抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。
TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的該指標(biāo)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。人芳基硫酸酯酶A(ASA)是催化苯酚硫酸酯水解成苯酚和硫酸的酶。有A、B、C三種類型。芳基硫酸酯酶A（ARSA）是一種溶酶體酶，可將腦磷脂3硫酸鹽（髓磷脂片的主要成分）分解為腦苷脂和硫酸鹽。ARSA缺乏會(huì)導(dǎo)致異色性白細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良（MLD），這是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的溶酶體貯積病，具有嚴(yán)重和進(jìn)行性神經(jīng)癥狀。重組人ARSA對(duì)應(yīng)于ARSA成熟肽，并具有硫酸酯酶活性。缺少芳基硫酸酯酶是導(dǎo)致異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良的原因之一。
應(yīng)用[4][5]
人芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA KIT用于產(chǎn)芳基硫酸酯酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究。
芳基硫酸酯酶(Arylsulfatase)是一種催化裂解硫酸酯鍵，生成相應(yīng)的醇和無機(jī)硫酸根的酶，該酶可以脫除瓊膠分子中的硫酸根，進(jìn)而可以替代對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重、產(chǎn)品得率低的化學(xué)方法，用于制備高品質(zhì)的瓊脂糖。菌株經(jīng)革蘭氏染色為陰性，需氧，彎桿狀，生理生化特征驗(yàn)證及16S rDNA序列分析確定為海單胞菌屬，并將其命名為Marinomonas sp.FW-1，簡(jiǎn)稱FW-1。證實(shí)了菌株FW-1的產(chǎn)酶能力后，選取常用的pNPS法對(duì)其產(chǎn)酶能力進(jìn)行定量分析。采用單因素-響應(yīng)面方法對(duì)菌株FW-1產(chǎn)芳基硫酸酯酶的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，其培養(yǎng)基組分為(w/v)：瓊脂0.2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.5%，NaCl2.89%，MgCl2·6H200.412%，KCl0.1%，CaCl20.02%，K2HPO4·3H200.013%，F(xiàn)eCl2·4H2O0.002%，MnCl20.09%，焦磷酸鈉0.043%，吐溫-801.87%；培養(yǎng)條件如下：初始pH為7，培養(yǎng)溫度為35℃，發(fā)酵時(shí)間為72h，接種量為1%，250mL錐形瓶裝液量為50mL。在上述培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件下，菌株FW-1的產(chǎn)酶能力為1.07U/mL，酶活力相對(duì)于優(yōu)化前提高了4.28倍。
菌株FW-1能夠穩(wěn)定地產(chǎn)生芳基硫酸酯酶，該酶主要位于菌體細(xì)胞內(nèi)部,在最適培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)72h后，發(fā)酵液經(jīng)低溫離心、超聲波細(xì)胞破碎、硫酸銨分級(jí)沉淀、透析除鹽、超濾濃縮、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳原位檢測(cè)及分離后得到粗酶液。純度鑒定及分子量測(cè)定表明該酶的分子量約為60kDa。酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)表明，芳基硫酸酯酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別是45℃和11。該酶在4℃以下保存時(shí)較為穩(wěn)定，在4℃放置72h后，酶活仍保留在95%以上，酶的熱穩(wěn)定良好，25℃保溫48h后，酶活剩余90%左右，但當(dāng)溫度大于35℃時(shí)，6h以后酶活就開始急劇下降。該酶在pH為7.0~11.0時(shí)具有良好的穩(wěn)定性。當(dāng)金屬離子濃度為0.1mM/L時(shí)，K+、Ba2+和Ca2+對(duì)芳基硫酸酯酶酶活力具有顯著的促進(jìn)作用，Hg2+能夠抑制芳基硫酸酯酶酶活力，酶活下降了59%；當(dāng)離子濃度為1mM/L時(shí)，Ba2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+及Ca2+對(duì)芳基硫酸酯酶酶活力具有顯著的促進(jìn)作用，Hg2+同樣能夠有效地抑制芳基硫酸酯酶酶活力，酶活大幅度下降了80%。利用純化后的芳基硫酸酯酶對(duì)瓊膠進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該酶可以有效地脫除瓊膠中的硫酸根，對(duì)石花菜和江蘺瓊膠的硫酸根脫除率分別為86.11%和89.61%。
參考文獻(xiàn)
[1]Protein release from alginate matrices[J].Wayne R.Gombotz,Siow Fong Wee.Advanced Drug Delivery Reviews.2012
[2]Partial characterization of sulfohydrolase from Gracilaria dura and evaluation of its potential application in improvement of the agar quality[J].Mahendra K.Shukla,Manoj Kumar,Kamlesh Prasad,C.R.K.Reddy,Bhavanath Jha.Carbohydrate Polymers.2011(1)
[3]Practical and reliable enzyme test for the detection of Mucopolysaccharidosis IVA(Morquio Syndrome type A)in dried blood samples[J].Marli V.Camelier,Maira G.Burin,Jurema De Mari,Taiane A.Vieira,Giórgia Marasca,Roberto Giugliani.Clinica Chimica Acta.2011(19)
[4]Steroid sulfatase and estrogen sulfotransferase in human carcinomas[J].Takashi Suzuki,Yasuhiro Miki,Yasuhiro Nakamura,Kiyoshi Ito,Hironobu Sasano.Molecular and Cellular Endocrinology.2010(2)
[5]王志朋.產(chǎn)芳基硫酸酯酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[D].中國(guó)海洋大學(xué),2014.