背景[1-3]
人二氫嘧啶酶樣3(DPYSL3)ELISA KIT應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中二氫嘧啶酶樣3(DPYSL3)水平。用純化的二氫嘧啶酶樣3(DPYSL3)抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被單抗的微孔中依次加入二氫嘧啶酶樣3(DPYSL3)，再與HRP標(biāo)記的二氫嘧啶酶樣3(DPYSL3)抗原結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的二氫嘧啶酶樣3(DPYSL3)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中二氫嘧啶酶樣3(DPYSL3)濃度。
操作步驟
1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2．根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時(shí)。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8．取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
9．在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
應(yīng)用[4][5]
用于5-FU代謝相關(guān)酶檢測(cè)及臨床意義研究
探討結(jié)直腸癌患者5-FU代謝相關(guān)酶表達(dá)水平與5-FU療效、毒性反應(yīng)及其與臨床病理的相關(guān)性。方法對(duì)58例結(jié)直腸癌患者,術(shù)前取血應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定血內(nèi)源性二氫尿嘧啶(UH2)/尿嘧啶(U)值代表血DPD活性;采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)癌組織和正常結(jié)直腸粘膜組織中的TP、TS表達(dá)。評(píng)價(jià)患者血DPD活性與5-FU化療毒性及TP、TS表達(dá)情況與5-FU化療療效、臨床病理因素之間的相關(guān)性。結(jié)果1結(jié)直腸癌組織的TP表達(dá)水平明顯高于正常粘膜組織,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);進(jìn)一步分層分析表明低組織分化者TP陽(yáng)性率高于中高分化者;Dukes分期越晚、以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者TP表達(dá)陽(yáng)性率越高;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組TP表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。治療相關(guān)分析顯示TP(+)者具有一定的生存優(yōu)勢(shì),腫瘤進(jìn)展時(shí)間(TTP)顯著長(zhǎng)于TP(-)者〔P<0.05〕。
參考文獻(xiàn)
[1]Thymidine Phosphorylase and Dihydropyrimidine Dehydrogenase Expression Levels in Tumor and Normal Tissue Specimens of T3 Human Colorectal Carcinoma[J].Atsushi Okita,Kazunori Tsukuda,Masakazu Murakami,Tetsuya Ota,Hiroyoshi Doihara,Manabu Suda,Tomoharu Nakano,Kinya Matsuoka,Eiji Suzuki,Minoru Naito,Akio Andou,Nobuyoshi Shimizu.Surgery Today.2006(4)
[2]Influence of chemotherapeutic agents and cytokines on the expression of 5-fluorouracil-associated enzymes in human colon cancer cell lines[J].Kaori Miyazaki,Takeshi Shibahara,Daisuke Sato,Kazuhiko Uchida,Hideo Suzuki,Hirofumi Matsui,Akinori Yanaka,Akira Nakahara,Yasushi Matsuzaki.Journal of Gastroenterology.2006(2)
[3]Thymidine phosphorylase,dihydropyrimidine dehydrogenase and thymidylate synthase mRNA expression in primary colorectal tumors—correlation to tumor histopathology and clinical follow-up[J].International Journal of Colorectal Disease.2006(3)
[4]Thymidine phosphorylase and dihydropyrimidine dehydrogenase activity in colorectal carcinoma and patients prognosis[J].Masahide Ikeguchi,Masato Makino,Nobuaki Kaibara.Langenbeck’s Archives of Surgery.2002(5-6)
[5]邢洪存.5-FU代謝相關(guān)酶檢測(cè)及臨床意義[D].吉林大學(xué),2006.