概述[1]
本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)菌，再通過離心吸附柱在高鹽和低pH條件下高效結(jié)合溶液中的DNA。離心吸附柱中采用的特制玻纖膜材料可高效、與一吸附DNA。本試劑盒適用于提取5-30 ml過夜培養(yǎng)的大腸桿菌，質(zhì)粒提取得率和質(zhì)量與不宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細(xì)胞的裂解、質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素等因素有關(guān)。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接、轉(zhuǎn)化、文庫篩選、體外翻譯、轉(zhuǎn)染一些常規(guī)的傳代細(xì)胞等。
試劑盒組成[1]
儲存條件[1]
試劑盒可置于室溫（15-25℃）干燥條件下，可保存12個月，更長時間的保存可置于4℃。注意：次使用前將RNase A加入Solution I中混勻后建議置于4℃保存；Solution III 建議置于4℃保存。
注意事項[1]
1. Solution I 在使用前應(yīng)先加入RNase A（將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻后4℃保存。
2. Solution II 如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子，以避免空氣中的CO2不Solution II 中的NaOH反應(yīng)，從而造成溶液裂解效率下降。
3. DNA Wash Buffer 在使用前先加入無水乙醇（按試劑盒包裝規(guī)定的體積加入）。
4. 所有離心步驟均為使用常規(guī)臺式離心機室溫下進(jìn)行離心。
5. 去蛋白液PE可以有效去除殘留的蛋白污染，當(dāng)宿主菌為endA+（TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列）等核酸酶含量較高的菌株時，則推薦使用去蛋白液PE。
操作方法[1]
1. 取5-30 ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機，4,000 rpm 離心3 min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。
2. 向有菌體沉淀的離心管中加入2 ml Solution I（已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀，然后靜置5 min。
注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。
3. 向離心管中加入2 ml Solution II，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。
注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片斷。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時間丌應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解丌徹底，應(yīng)減少菌體量。
4. 向離心管中加入2.8 ml Solution III，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm離心10 min。
注意：Solution III 加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。
5. 將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱中 （吸附柱放入收集管中），注意盡量丌要吸出沉淀。12,000 rpm離心30 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
6. 可選步驟：向吸附柱中加入3.5 ml去蛋白液 Solution PE，12,000 rpm離心30 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒DNA，推薦采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），這步可省略。
7. 向吸附柱中加入3.5 ml DNA Wash Buffer（使用前請先檢查是否已加入相應(yīng)體積的無水乙醇），12,000 rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
8. 重復(fù)操作步驟7。
9. 將吸附柱放入收集管中, 12,000 rpm離心1 min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除。
10. 將吸附柱開蓋，置于室溫放置3-5 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11. 將吸附柱置于一個干凈的15ml離心管中，向吸附膜的中間部位滴加0.5-1.0 ml洗脫緩沖液Elution Buffer（或者ddH2O），室溫放置2 min，12,000 rpm離心2 min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。注意：將洗脫緩沖液Elution Buffer（或者ddH2O）預(yù)熱至60℃將有助于提高質(zhì)粒洗脫的效果。
主要參考資料
[1] 質(zhì)粒中量提取試劑盒（離心柱型）