概述[1]
質(zhì)粒大量提取試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的 DNA 的原理特異性提取質(zhì)粒 DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附 DNA，可限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機化合物，一般從 50-100ml 大腸桿菌 LB 培養(yǎng)液中，可快速提取 200-300µg 高純度高拷貝的質(zhì)粒DNA，提取率達(dá) 85-90%。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒 DNA 可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗。
使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液Ⅰ在使用前先加入 RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。
試劑盒內(nèi)容[1]
操作步驟[1]
1. 收集 50-100ml 過夜培養(yǎng)的菌液 11000rpm 離心 10 分鐘，盡量吸除上清(菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中)。
2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入 5ml 溶液Ⅰ (請先檢查是否已加入 RNaseA) ，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。
3. 向離心管中加入 5ml 溶液Ⅱ ，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次使菌體充分裂解。 注意：①翻轉(zhuǎn)一定要溫和，以免污染細(xì)菌基因組 DNA。②作用時間不要超過 5 分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。
4. 向離心管中加入 7ml 溶液Ⅲ ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀(如菌液過多，可在此步放置 5 分鐘，以盡可能的降解 RNA)。11000rpm 離心 10 分鐘，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，注意盡量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。 如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5. 將上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置 2-3 分鐘，11000rpm 離心 30-60 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中(如為提高得率，可將收集管中的液體加入吸附柱再次吸附一次)。
6. 向吸附柱中加入 8ml 漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，11000rpm 離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7. 向吸附柱中加入 6ml 漂洗液，11000rpm 離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8. 11000rpm 離心 5min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影晌后續(xù)的實驗如酶切、PCR 等。
9. 將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 1-2ml 經(jīng) 65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置 5min，11000rpm 離心 2min，收集質(zhì)粒溶液用于后續(xù)實驗。
10. 為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 5min， 11000rpm 離心 2min。
注意事項[1]
1. 使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。溶液Ⅱ 、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。
2. 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 500ul，體積過小影響回收效率；洗脫液的 pH 值對洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調(diào)至此范圍)， pH 值低于 7. 0 會降低洗脫效率。DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防 DNA 降解。
3. 如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?10kb 的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用 400-800ml 過夜培養(yǎng)物，同時按照比例增加溶液Ⅰ 、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當(dāng)?shù)难娱L時間，以增加提取效率。
4. DNA 濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒 DNA 純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。 得到的DNA 可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。 DNA 應(yīng)在 OD260處有顯著吸收峰，OD260值為 1相當(dāng)于大約 50µg/ml 雙鏈 DNA、 40µg/ml 單鏈 DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為 1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為 pH 值和離子存在會影響吸光值，但并不表示純度低。
主要參考資料
[1] 質(zhì)粒大提試劑盒說明書