Western及IP細胞裂解液概述^[1][2]

Western及IP細胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一種在非變性條件下裂解細胞的裂解液。本細胞裂解液裂解的細胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)、免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等。

Western及IP細胞裂解液的主要成分：20mM Tris (pH 7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多種抑制劑?？梢杂行б种频鞍椎慕到?，并維持原有的蛋白間相互作用。

Western及IP細胞裂解液使用說明^[1][2][3]

對于培養(yǎng)細胞樣品：

1. 融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

2. 對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒后，細胞就會被裂解。

對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

3. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

對于組織樣品：

1. 把組織剪切成細小的碎片。

2. 融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

3. 按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。)

4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態(tài)的不同組織有所不同。

6. 如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

主要參考文獻

[1] Zhang X, Chen S, Wang Y. Honokiol up-regulates prostacyclin synthease protein expression and inhibits endothelial cell apoptosis. Eur JPharmacol. 2007 Jan 5;554(1):1-7.

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[3]. Dong X, Wang JN, Huang YZ, Guo LY, Kong X. Cell - penetra ting Peptide PEP - 1- med ia ted Tran sduction of Enhanced Green Fluorescen t Prote in in to Human Aortic SmoothMuscle Cells. J YMC.2007 Apr;26(2):71.