背景^[1-4]

SEQPLEX RNA擴(kuò)增試劑盒用于全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增（WTA）的SeqPlex RNA擴(kuò)增試劑盒，專用于幫助對(duì)小量或降解/高度片段化的RNA（如來自福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣品FFPE的RNA）進(jìn)行二代測(cè)序（NGS）。SeqPlex試劑盒可對(duì)這類RNA以及其他用于NGS的小量/高度片段化RNA樣品進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。SEQPLEX RNA擴(kuò)增試劑盒可在進(jìn)入常用深度測(cè)序平臺(tái)工作流程之前為總RNA或分離后的mRNA提供一種擴(kuò)增方法，在8小時(shí)或更短的時(shí)間內(nèi)從低納克至皮克級(jí)總RNA生成微克級(jí)的雙鏈cDNA，適合對(duì)組織、培養(yǎng)細(xì)胞、福爾馬林固定的樣品或血清中分離的RNA（包括不含polyA尾的RNA）進(jìn)行擴(kuò)增，并同時(shí)保持未擴(kuò)增樣品中所發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)模式。

測(cè)序準(zhǔn)備包括三個(gè)步驟。首先，用具有半簡(jiǎn)并3'末端以及指定通用5'末端的引物對(duì)樣品RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。隨著DNA聚合進(jìn)行，置換的單鏈可作為引物退火和延伸的新模板。接下來，由側(cè)翼為單個(gè)通用引物序列的隨機(jī)重疊片段組成的雙鏈cDNA文庫產(chǎn)物，在優(yōu)化的PCR條件下擴(kuò)增生成WTA（全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增）產(chǎn)物。從納克級(jí)完整起始RNA開始，大部分的擴(kuò)增產(chǎn)物大小范圍為200至400 bp。對(duì)于受損的RNA和皮克級(jí)高質(zhì)量RNA，可得到150至250 bp大小范圍。最后，將SeqPlex擴(kuò)增RNA與深度測(cè)序工作流程整合需要消除每個(gè)擴(kuò)增子的引物序列。在樣品制備之前需要完成有效的引物去除步驟。除了深度測(cè)序外，SeqPlex擴(kuò)增產(chǎn)品還可適用于芯片靶標(biāo)或qPCR模板——無論是否進(jìn)行引物去除

應(yīng)用^[5][6]

用于深度測(cè)序鑒定玉米病毒及感病玉米組織中小RNA分析

明確玉米病毒種類及生物學(xué)特性是防治玉米病毒病發(fā)生的關(guān)鍵。深度測(cè)序技術(shù)突破了傳統(tǒng)病毒鑒定方法的局限性,能同時(shí)檢測(cè)植物樣品中已知的和未知的、含量高及含量低的所有RNA病毒、DNA病毒以及類病毒。這種新的測(cè)序技術(shù)極大地革新了植物病毒的檢測(cè)方法,已成為目前病毒鑒定最為重要的前沿技術(shù)之一。

本研究利用小RNA深度測(cè)序技術(shù)鑒定了云南省和貴州省玉米病毒病的種類。通過contigs拼接和比對(duì)共鑒定了7種玉米病毒,分別為3種未知的RNA病毒并依次暫命名為：玉米黃化花葉病毒(Maize yellow mosaic virus,MYMV),玉米相關(guān)的形影病毒(Maize-associated umbravirus,MAUV)以及玉米相關(guān)的整體病毒1(Maize-associated totivirus1,MATV1);1種國(guó)內(nèi)首次報(bào)道的DNA病毒：留尼旺玉米線條病毒云南分離物(Maize streak Reunion virus-YN isolate,MSRV-YN);3種已知的RNA病毒：玉米褪綠斑駁病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV),甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV),南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)。

利用病毒來源的contigs以及小RNA設(shè)計(jì)引物,對(duì)上述3種未知的RNA病毒以及MSRV-YN進(jìn)行了全長(zhǎng)基因組的克隆。MYMV基因組全長(zhǎng)5,642nt,共編碼6個(gè)開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF),其ORF的大小及編碼策略與黃癥病毒科馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus,Luteoviridae)成員非常相似。全基因組核苷酸進(jìn)化樹分析以及6個(gè)ORFs的氨基酸序列進(jìn)化樹分析均顯示MYMV與黃癥病毒科馬鈴薯卷葉病毒屬病毒成員聚為一簇,與該屬成員玉米黃矮病毒-ⅠMV(Maize yellow dwarf virus-RMV)形成一個(gè)小的分支,具有最高的序列同源性,兩者核苷酸序列相似性為73%,表明MYMV是該屬的一個(gè)新的病毒成員。同時(shí),構(gòu)建了MYMV的全長(zhǎng)cDNA侵染性克隆,RT-PCR及Northern blot結(jié)果均顯示該侵染性克隆能成功地系統(tǒng)侵染本氏煙(Nicotiana benthamiana)。

參考文獻(xiàn)

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